קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

שיתוף-אימונופרציפציה מרובה כמותית, או QMI, מאפשר למשתמשים למדוד בו-זמנית מאות אינטראקציות בינאריות ברשת אינטראקציה מוגדרת מראש של חלבונים. על ידי ביצוע מספר IPs משותף בו זמנית באותו lysate, טכניקות bioinformatics אז יכול לבחון כיצד קבוצות של עמותות שיתוף לשנות באופן מתואם. ההתמדה היא זמן רב לפתח, אבל ברגע פאנל QMI הוא ביד נתונים בקנה מידה רשת ניתן לאסוף על מערכות העברת אותות בהתמדה פשוטה יחסית לילה.

QMI דורש צינור מדויק של דגימות שונות reagents לתוך 96 צלחות באר. יש לרשום הערות זהירות בעת הגדרה והפעלה של כל בדיקה כדי למנוע שגיאות. להכנת מדגם ו immunoprecipitation, להתחיל על ידי lysing את המדגם בחומר ניקוי מתאים עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז עבור דגירה 15 דקות על קרח.

בסוף הדגירה, לסובב את המדגם כדי להסיר את הממברנות והפסולת ולבצע בדיקה BCA על supernatant כדי לקבוע את ריכוז החלבון על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר נרמול ריכוזי החלבון, הכינו תערובת אב של חרוזים מגנטיים המכילה כ-250 חרוזים מגנטיים מכל מחלקה לבא. השתמש בהפרדה מגנטית כדי לשטוף את תערובת חרוזים מגנטיים פעמיים במאגר Fly P לפני שימוש חוזר את חרוזים ב 20 microliters של מאגר לטוס P לכל מדגם.

לאחר צינור יסודי, aliquot 20 microliters של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge קר קרח אחד לכל מדגם ולהוסיף כמויות שוות של lysate עם ריכוזי חלבון מנורמל לכל צינור עבור immunoprecipitation. לאחר מכן מחלקים כל דגימת ליסאט לצינור אחד עבור כל צלחת המנוהלת ומאימונפרציפיט את הדגימות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס לילה מוגן מפני אור. למחרת בבוקר להשתמש במדף חרוזים מגנטיים כדי להסיר את lysate מהסט הראשון של צינורות ולשטוף את חרוזים פעמיים ב 500 microliters של קרח קר לעוף P חוצץ לכל לשטוף.

לאחר חישוב נפח ההתכווצות מחדש, המתן מחדש את האימונופריטים בנפח המחושב של מאגר Fly P קר כקרח. ביסודיות resuspend את חרוזים מגנטיים על ידי צינורות עדינים ולהפיץ 25 microliters של חרוזים לאורך היטב על פני שטוח תחתית 96 צלחת היטב על הקרח. בצלחת אחרת של 96 בארות, מדוללים על ידי נוגדני בדיקה attinilated לריכוז עבודה פעמיים.

השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להפיץ 25 microliters של כל דילול נוגדן בדיקה לתוך בארות המתאימות של חרוז מגנטי המכיל צלחת הבדיקה לנער במהירות גבוהה על שייקר צלחת אופקית לערבב מחדש את חרוזים מגנטיים. לאחר ערבוב, להפחית את המהירות עבור דגירה של שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ טיסה P טרי לכל לשטוף על מכונת כביסה צלחת מגנטית בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הכביסה האחרונה, להשתמש שוב את חרוזים ב 50 microliters של סטרפטבידין PE מדולל אחד עד 200 במאגר P לטוס. מנערים את התערובת ומערבבים מחדש את חרוזים לפני הדגירה את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מוגנים מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם חיץ לטוס P על מכונת כביסה צלחת מגנטית בארבע מעלות צלזיוס ו resuspend את חרוזים ב 125 microliters של חיץ P לטוס.

לנער את הצלחת במשך דקה אחת ב 900 סיבובים כדי לשימוש חוזר ביסודיות את חרוזים לטעון את הצלחת לתוך ציטומטר זרימה refridgerated. בתוכנת ציטומטר הזרימה, בחר הגדרת יעד גבוהה של RP1, מצב עצירה של 1,000 חרוזים לאזור ונפח דגימה של 80 מיקרוליטרים. השהה את הריצה באמצע הדרך והתן מחדש את חרוזים כדי למנוע התיישבות.

בסוף הריצה, יצא את קבצי הנתונים בתבנית XML. כדי לבצע ניתוח ANC, מלא את קובץ הקלט של ANC כדי לשקף את פרטי העיצוב הניסיוני ולהפעיל את התוכנית, אשר יכתוב קובץ CSV לתוך הספריה הפעילה. הקובץ מסתיים בהיטים.

csv ידווח על עמותות החלבון השונות באופן משמעותי ברמה חיובית כוזבת של 0.05 בין הבקרה לתנאי הניסוי בלפחות שלושה מתוך ארבעה שכפולים ניסיוניים. עבור ניתוח רשת מתאם משוקלל, הדבק את כותרות העמודות של פלט קובץ הנתונים על-ידי Matlab המסתיים ב- mfi. csv לתוך העמודה הראשונה של גיליון אלקטרוני חדש ולהוסיף את העמודות ניסוי מספר טיפול לטיפול ניסיוני וכל משתנים אחרים שיש לנתח.

שמור קובץ זה כתכונות. csv ולפתוח R סטודיו. הגדר את ספריית העבודה לתיקיה המכילה את ה- mfi.

CSV ותכונות. קובצי csv, סמן מקטעי קוד ולחץ על Command Enter כדי להפעיל את פקודות R כפי שצוין בקובץ הפקודה עם ההערות. מודולי ניתוח רשת מתאם משוקלל בקורלציה משמעותית עם כל תכונה ניסיונית יהיה פלט כקובץ גרפי ואת המתאם של כל אינטראקציה עם כל מודול יהיה פלט כקובץ CSV.

עבור כל אינטראקציה בקובץ הפלט ANC, זהה אם אינטראקציה זו משמעותית גם על-ידי CNA וצור עמודה חדשה המציינת אם כל להיט ANC הוא גם להיט CNA. המר את הערכים כדי לרשום שני שינויי קיפול ולחשב את הערך הממוצע עבור כל כניסות CNA של איחוד ANC. לבסוף, צור גיליון אלקטרוני חדש עם כל להיט CNA של איחוד ANC הרשום על-ידי יעד immunoprecipitation שלו בעמודה אחת, יעד הבדיקה שלו בעמודה השניה וערך שינוי הקיפול שלו בעמודה השלישית.

יבא קובץ זה לתוך Cytoscape כרשת כדי ליצור דיאגרמת קצה צומת. אינטראקציות חלבון בביטחון גבוה שזוהו על-ידי שתי הגישות הסטטיסטיות הבלתי תלויות חזותיות כדיאגרמות קצה צומת באמצעות תוכנת הקוד הפתוח, Cytoscape, או כמפות חום המשתמשות בקוד R ובהוראות ניתוח הכלולות בחומר המשלים. לאורך כל הפרוטוקול, משתמשים צריכים לדאוג pipette במדויק, כדי לשמור על רשומות קפדניות, ולשמור על הדגימות קרות בכל עת.

השתמשנו ב- QMI כדי להבין כיצד מסלולי החלת אותות מבדילים בין סוגי קלט שונים ומשלבים מידע מקולטנים מרובים.