תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

מיקרו-שאיפה של תא יחיד היא שיטה להשלמת הטכניקות השונות המשמשות בתחום המיקרוביולוגיה בכלל ובווירולוגיה בפרט. זה יכול לענות על שאלת מפתח ולפתור בעיות שנתקלו במהלך בידוד וירוסים ענקיים על ידי הפרדת וירוס מתערובת ויראלית המציגה וירוס שפע נמוך כפי שהיה במקרה של וירוסים מחזור, וירוס clandisinal, ווירוס uzibati מאחד אחר, שהוא Faustovirus, נוכח בשפע גבוה בכל מקרה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא השימוש באסטרטגיה עקיפה.

הוא מורכב מהפרדה ושיבוט של המארח הנגוע כדי להשיג הפרדה ויראלית. לכן, שיטה זו מנטרת את השלבים השונים מלכידה לשחרור תאים ומאשרת את תהליך המיון על ידי תצפית מיקרוסקופית. לבסוף, ביולוגיה מולקולרית משמשת לאישור המיון והמיקרוסקופיה האלקטרונית כדי להתבונן בחלקיקים הנגיפיים המופרדים.

גישה זו תפתור את הבעיה העיקרית של הפרדת וירוסים. זה אפשרי לשיבוט ameba או שיבוט פרוטיסטים באופן כללי. האדם שמנסה להשתמש בטכניקה זו בפעם הראשונה חייב להיות קפדני ומדויק בעת שליטה בלחץ.

השליטה החזותית חיונית לאישור לכידה ושחרור של תא אחד בלבד. השתמש Vermamoeba Vermiformis, זן CDC 19, כתמיכה בתא. הוסף 30 מיליליטר של מדיום PYG ושלושה מיליליטר של האמבה בריכוז של אחד 10 לתאים השישי למיליליטר בבקבוק תרבות תא 75 ס"מ מרובע.

לשמור על התרבות ב 28 מעלות צלזיוס באינקובטור. לאחר 48 שעות, להעביר 10 מיליליטר של תרבות תא amoeba על שקופית ספירה ולמקום אותו תחת מיקרוסקופ לכמת את האמבה. כדי לשטוף, לקצור 30 מיליליטר של תרבות התא בצינור גלולה אמבה על ידי צנטריפוגה ב 720 פעמים G במשך 10 דקות.

הסר את supernatant ו resuspend את גלולה בנפח המתאים של אמצעי רעב כדי לקבל את הריכוז של אחד פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר. הכן את התמיכה התאית עם תוספת של סוכן מיקרוביאלית. בקבינט biosafety, להוסיף פעם אחת 10 כדי השישי של תרבות אמבה לתוך שני מיליליטר של מדיום רעב.

ואז לחסן 100 מיליליטר של פתרון המניות המכיל את התערובת של וירוסים לתוך התמיכה בתרבות תאים amoebae בריבוי של זיהום של 0.01. דגירה התמיכה בתרבות תאים amoebae נגוע. מוסיפים 30 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 14 שעות או עד השפעות ציטופתיות נגרמות כגון עיגול אמובל או תזה.

לאחר מכן, השתמש במזרק כדי לאסוף את המדיה ולסנן באמצעות מסנן חמישה מיקרון כדי להסיר פסולת תאית. בצע דילול דגנים של המדגם הנגיפי במדיום רעב בארות שונות. לחסן שני מיליליטר של אחד פעמים 10 כדי Vermamoba Vermaformis השישי הכלול בכל צלחת פטרי עם 100 מיליליטר של inoculum תערובת.

לאחר מכן, מניחים את מנות פטרי לתוך שקית ניילון אטום ב 30 מעלות צלזיוס. בשש שעות לאחר ההדבקה, התבונן בצלחות פטרי עם מיקרוסקופיה אופטית הפוכה ובדוק מורפולוגיה של התא כל ארבע עד שמונה שעות. הטיפול האנטי-מיקרוביאלי הוא לתמיכה התאית.

בחר בין מנות פטרי אלה נעדרים כל זיהום חזותי על ידי סוכנים פטרייתיים חיידקיים עם ראיות של השפעה ציטופתית של אמבה עקב וירוסים עם טרום תיזה שלב עיגול של אמבה כדי למנוע שאיפה של חלקיקים ויראליים. הגדר תחנת עבודה עם מיקרו מניפולטור, התקן לחץ שליטה ידני, מיקרוסקופ הפוך, מודולי מנוע הכנס-הפעל, מצלמה ומודול מחשב. בחר נימי מיקרו של 20 מיקרון קוטר פנימי כדי לאפשר את התחזוקה של מיקום פנימי שחרור קל של התא.

תקן את זווית ההפעלה של מערכת האחיזה במודול ממונע ב-45 מעלות. בצע התקנה כפולה, תחילה על מערכת האחיזה ולאחר מכן על נימי מיקרו. תתמקד בתאים.

כדי לשכפל תאים, מניחים את צלחת פטרי המכילה שני מיליליטר של אמבה נגועה מתחת למיקרוסקופ. התמקדו תחילה בתאים ולאחר מכן במיקרו נימי שקוע בתרבות. לקטוף תא בודד מעוגל ולקרב את נימי המיקרו למיקרומניפולטור.

להפעיל שאיפה רכה עם בקרת לחץ ידנית על התא לוקח אותו בתוך נימי מיקרו הסר את התא הבודד מן המדגם הראשון ולשחרר אותו תמיכה של תאים של amoebae. ואז לה הדגירה אותו ב30 מעלות צלזיוס. בזהירות לשלוט בלחץ כדי להיות מסוגל לשאוף תא אחד ולשלוט בשאיפה שלך על ידי התבוננות של שחרורו של תא אחד.

לנהל תצפיות יומיות עם מיקרוסקופ אופטי הפוך כדי לבחון את המראה של התאים כדי לפקח על הופעתה של ההשפעה הציטופתית. עכשיו להפעיל מערכת מיצוי אוטומטית כדי לחלץ DNA מתוך חלק דגימות תרבות חיובית שבו אפקט ציטופתי הוא ציין. עיצוב פריימרים כדי להגביר גנים עניים ביאורים כמו RBP2 עבור Faustovirus, חלבון capsid העיקרי עבור Usurpatvirus, וחלבון capsid קטין עבור Clandestinovirus.

בצע PCR סטנדרטי באמצעות תרמוסיקלר על פי כתב היד. לבצע 20 microliliters של תגובות PCR עם 50 micromolar של כל פריימר, 1X מאסטר מיקס, ומים חופשיים ריבונוקלאז. הפעל את מוצרי PCR עם כתם ג'ל DNA על 1.5% ג'ל אגרוז במתח של 135 וולט ולהדמיין עם UV. פרוטוקול זה ממטב תהליך מיקרו-ניהול עם שאיפה מיקרו תא יחיד.

טכניקה זו מאפשרת לכידת אמבה מעוגל ונגוע ושחרורה בצלחת חדשנית המכילה אמבה לא נגועה. גישה זו בודדה בהצלחה וירוס ענק חדש בשפע נמוך בשם Userpatvirus LCD7. Userpatvirus שלך נצפתה רק שיבוט שבע עם נוכחות של ה-DNA LCD7 Userpatvirus והיעדר DNA Faustovirus.

מיקרוסקופ אלקטרונים חשף את המראה של Clandestinovirus ST1, אשר יש מורפולוגיה icosahedral טיפוסי ללא fibrils, כמו גם USurpatvirus LCD7 עם קפסיד icosahedral של כ 250 ננומטר. ציטומטריה נמוכה מאשרת את החפיפה של אוכלוסיות פאוסטווירוס ונאובוירוס. לאחר השליטה, הליך זה יכול להיעשות בקלות.

הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא הצורך של טקס תצפיות מינימלי לגבי גודל הישויות עם טיפול טוב של מוסמך של תחנת העבודה ואת הבדיקה של כל בעיית זיהום. גישה זו יכולה לשמש כטכניקת מיון על בסיס מורפולוגיה של התא. כיום הוא משמש במעבדה שלנו לשיבוט של אמבה ספציפית.

נקודה קריטית אחת בטכניקה זו היא לשמור על שלמות התא. אכן, אנחנו יכולים להיות כמה בעיות עם אי התבוננות של התא או לשחרר. הסיבה לכך היא בעיקר התפוררות התא לתוך נימי מיקרו.

שיטה זו יכולה להיות חלופה יעילה כאשר טלמטריה פגומה ומיון עובדות אינם זמינים וכאשר מגיעים למגבלות טכניקה ספציפיות. אל תשכח כי במקרים מסוימים התא אינו משוחרר מן נימי מיקרו. זאת, בין השאר, בשל מאפייני אמבה ויכולתם להסתגל ולאחר מכן מממברנה התא.