תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין
31 במאי 2020
האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.
פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי אלמוגים חיים ברמה תיאורית שלא הייתה אפשרית קודם לכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה לרמה של ספציפיות תאים שעד כה הייתה ברובה בלתי ניתנת להשגה. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שאנון סיי, עמיתת מחקר מהמשאב המשותף של ציטומטריית הזרימה במרכז הסרטן המקיף סילבסטר.
כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה למיון תאי אלמוגים חיים, פתח תבנית פרוייקט חדשה בתוכנת ציטומטר הזרימה ובחר את הלייזרים המתאימים לניתוח בלוח הלייזר. לאחר מכן, צור פיזור צדדי לעומת חלקת פיזור קדימה בחלקות המתאימות לקביעת אסטרטגיית הגתה והניתוח. לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה ומיון של תאי האלמוגים החיים, טען את דגימת התאים שאינם נגועים בתא הדגימה של הציטומטר והתחל את תהליך הקריאה.
מאז תאי האלמוגים הם שבירים במיוחד, לשמור על לחץ ציטומטר נמוך כדי למנוע תמוגה התא. בעלילה פיזור, להתאים את מתח מכפיל התמונה למרכז הנקודות ולהתחיל להקליט את האירועים. בחלקת פיזור קדימה לעומת צד, ליצור שער סביב התאים בסביבות 10 עד 4 סימן על ציר x פיזור קדימה.
החלף את דגימת הבקרה בדגימה הראשונה של תאים מוכתמים והקליט כ- 10,000 תאים לפני ההושהות. לאחר מכן שער את האירועים הייחודיים לקבוצת המדגם המוכתמת. כדי למיין תאי אלמוגים חיים, לאחר בחירת אוכלוסיית התאים המעניינים את תוכנת ציטומטר הזרימה, מקם צינור מיקרוצנטריפוגה אחד המכיל 250 עד 500 מיקרוליטרים של פתרון האיסוף המתאים לתא איסוף הציטרומטר עבור כל אוכלוסייה למיון.
לאחר פרק זמן מתאים עבר כדי לשטוף את הפסולת, להתחיל למיין את האוכלוסייה הרצויה לאסוף בכל מקום מ 10, 000 עד כמה מיליוני תאים. בכל פעם נעשה שימוש בכתם, מינים או סדרן חדשים, מיין לפחות 20, 000 תאים בעלי עניין ל-500 מיקרוליטרים של מדיום מכתים כדי לאפשר בדיקת טוהר על אוכלוסיית העניין ולניתוח מחדש של התאים ממוינים כדי לאשר שהאירועים נקראים בתוך השער המשמש למיון הראשוני. למחקרי במבחנה, אחסן את התאים ממוינים על הקרח עד שהם יועברו לאנקובטור או לסביבה מעקרת.
כדי להביא חלקיקים אחרים שאינם תאיים שאינם חולקים את אותה צורה או צפיפות כמו תאי האלמוגים ניתן להסיר מהניתוח על ידי יצירת בחירת שער על חלקת פיזור קדימה וצד. ניתן לא לכלול את התאים המתים על-ידי השוואת אות ה- DAPI של מתלי התאים שאינם מוכתמים ומוכתמים באמצעות היסטוגרמה ו- gating החוצה את התאים הגבוהים המבטאים DAPI. במקביל, תאים המארחים סימביודזיה של שפעת אוטומטית ניתן להסיר על ידי gating נגד תאים עם האות הגבוה בערוץ האדום הרחוק.
לאחר תהליך גתים איטרטיבי זה, התאים הנותרים מייצגים את אוכלוסיות תאי האלמוגים החיים ללא פגע חסרי סימביודזיה. תאים אלה יכולים להיות מסווגים לאחר מכן תת-כפילויות תאים שונים על ידי כתמים עבור תכונות כגון פעילות מיני חמצן תגובתי ו / או תוכן lysosome. זה קריטי לזכור כי תאים מסוימים הם שבירים יותר מאחרים ולהפעיל את התהליך הזה בזהירות רבה ככל האפשר.
לאחר שתאים מסוימים בודדו, ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות פונקציונליות של x-vivo כגון יצירת תרבויות תאים ויצירת פרופילים תעתיקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עוסק בצורך בהבנה מעמיקה יותר של תאי אלמוגים, החיוניים למגוון הביולוגי במערכות אקולוגיות ימיות. המחברים מציגים פרוטוקול חדש לבידוד ולסימון של אוכלוסיות תאים של אלמוגי אבן, תוך השגת רמה חסרת תקדים של ספציפיות תאית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה של אלמוגים
- טכניקות לבידוד תאים
- מגוון ביולוגי של מערכות אקולוגיות
רקע
- אלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות חיוניות לחיים הימיים.
- הידע הנוכחי על תפקודי תאי אלמוגים הוא מוגבל.
- בידוד של אוכלוסיות תאי אלמוגים ספציפיות הוא חיוני למחקר המשכי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ציטומטריית זרימה למיון תאים חיים
- אלמוג קשיח כאורגניזם מודל
- אסטרטגיית גייטינג (Gating) לזיהוי ובידוד סוגי תאים ספציפיים
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר זיהוי ומיון של אוכלוסיות תאי אלמוג חיים.
- מבטיח את טוהרן ואת חיוניותן של התאים הממוינים עבור בדיקות עתידיות.
- מקל על חקר תתי-אוכלוסיות ותפקודיהן.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה מהימנה לבידוד תאי אלמוגים, המגבירה את הפוטנציאל המחקרי.
- הממצאים תורמים תובנות בעלות ערך לגבי ביולוגיה של אלמוגים ובריאות המערכת האקולוגית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של אוכלוסיות תאים ספציפיות מרקמות מורכבות נותר אתגר קריטי בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות והפחתת סיכונים מכניסטיים. מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) מאפשר חקירה תאית ברזולוציה גבוהה, התומכת בביטחון ניבוי של תגובות ספציפיות למסלולים. יכולת זו רלוונטית באופן ישיר לזרימות עבודה של גילוי בביופארמה הדורשות בדיקות תפקודיות מדויקות ואפיון טרנסקריפטומי של סוגי תאים נדירים או שבירים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות ברזולוציה של תא בודד על ידי בידוד אוכלוסיות חיים לצורך תיקוף פונקציונלי.
- ערך תפעולי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי הפרדת תתי-אוכלוסיות של תאים חיוניים משאריות, תאים מתים ואיתחים הקשורים לסמביונטים.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי יצירת תשומות מטוהרות עבור בדיקות המשך המבהירות מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תרחיפי תאים חיוניים וסטנדרטיים המתאימים לבדיקות פונקציונליות הדירות ולמיפוי תגובה למינון.
- ערך תפעולי: קובע אסטרטגיות סינון (gating) המבטיחות מוכנות של הבדיקה וממזערות שונות בין הרצות ניסיוניות.
- יכולת הרחבה: מאפשר איסוף של מספר תאים מספיק (מ-10,000 עד למספר מיליונים) עבור סריקות רב-בארים ויישומי אומיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לבידוד עקבי של אוכלוסיות תאים הרלוונטיות למחלה לצורך מעקב מכניסטי.
- התאמת סממנים ביולוגיים: מקל על צביעה של סממני תגובה למעקה (למשל, רדיקלים חופשיים של חמצן, תוכן ליזוזומי) כדי להקריב פנוטיפים תאיים עם תוצאות תפקודיות.
- קידום מותאם סיכון: אוכלוסיות מטוהרות משפרות את מהימנות הנתונים במודלים פרה-קליניים, ובכך מפחיתות תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מדגימות הטרוגניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
FACS משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לקלטים תאיים מדויקים בכל שלב.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי בידוד אוכלוסיות תאי אלמוג חיים (או תאי יונקים מקבילים) לצורך חקירה תפקודית ספציפית למסלול מסוים.
- סריקה: מספק אוכלוסיות תאים סטנדרטיות וממוינות (gated) המשפרות את השחזוריות של הבדיקה ואת מהימנות הקריאה הכמותית.
- אנליטיקה: מייצר דגימות בדרגת טוהר גבוהה המאפשרות פרופיל טרנסקריפטומי, פרוטאומי או מטבולי מדויק לצורך השוואת תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני באמצעות הכנה עקבית של תת-קבוצות תאים חיוניות המגיבות למעמדים של סטרס.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר בפרויקטים הדורשים רזולוציה סוב-צלולרית, ללא תלות במערכת המודל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת רעשים מתאים שאינם תאי מטרה ומאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות gating הניתן לשחזור, מיון בלחץ נמוך ושיטות איסוף המשמרות את חיוניות התאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים ביולוגיים נקיים יותר, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים הנובע מהנחות שגויות לגבי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים באמצעות נתונים אמינים ספציפיים לתת-אוכלוסיות, המנחים את קריטריוני ההתקדמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגדרת ציטומטריה של זרימה, כולל בחירת לייזר, אופטימיזציה של מתח חשמלי והגדרת שערים (gating) של תרשימי פיזור עבור תאים שבירים.
- תלוי במיכשור המסוגל לבצע מיון בלחץ נמוך וזיהוי רב-פרמטרי (פיזור קדמי/צדי, ערוצי פלואורסצנציה).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, מצעי איסוף וספי שערים כדי להבטיח שחזוריות.
- חייב להתחשב בשונות של שבירות התאים בין מינים או תנאים שונים, דבר הדורש אופטימיזציה איטרטיבית של מאמץ גזירה ומשך הצביעה.
- מוגבל על ידי איכות הכנת הדגימות; דיסוציאציה אנזימטית או מכנית חייבת לשמר את שלמות האפיטופ ואת חיות התאים לצורך מיון מדויק.
