זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

זיהוי אינטראקציות פני השטח של התאים באמצעות גישות ביוכימיות הזמינות כיום עדיין מציב אתגרים טכניים. פרוטוקול זה מספק חלופה גנטית באמצעות גישת סינון התאים בסולם הגנום כדי לזהות את אינטראקציות ליגנד הקולטן על פני השטח של התא. שלא כמו רוב השיטות הקיימות האחרות, שיטה זו אינה מניחה הנחות לגבי הביולוגיה של הקולטנים.

הוא מספק הזדמנויות לזהות את האינטראקציות התיווך על ידי מגוון רחב של מולקולות פני השטח של התא. מולקולות פני השטח של התא נגישות ישירות לתרופות כגון נוגדנים חד שבטיים. לכן, לזיהוי אינטראקציות התיווך על ידי מולקולות אלה יכולות להיות השלכות טיפוליות חשובות.

שיטה זו חלה בדרך כלל על חוקרים המעוניינים לחקור את תהליכי האיתות והזיהוי התאיים במגוון רחב של הקשרים ביולוגיים, כולל אינטראקציות עצביות ואימונולוגיות, כמו גם אינטראקציות פתוגן מארח. הפרוטוקול דורש מכונת מיון תאים בתפוקה גבוהה ומכונות רצף הדור הבא. ודא כי מתקנים אלה זמינים לפני הפעלת הפרוטוקול.

התחל על ידי ביצוע שמונה דילולים סדרתיים של דגימות חלבון biotinylated בצלחת 96 באר להבטיח כי הנפח הסופי של כל דילול הוא לפחות 200 microliters ושבקרה תג בלבד כלול. הפוך צלחת כפולה של הדגימות על ידי הסרת 100 microliters מכל באר והעברתו לתוך צלחת חדשה 96 באר. כלול פקד חלבון תג בלבד שישמש כגשוש בקרה בכל החיבורים המחייבים.

הוסף 100 microliters של 0.1 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטבידין-PE ל בארות באחת הצלחות, ו 100 microliters של חיץ דילול ל בארות של הלוח השני. הדגירה את הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, לחסום את הבארים של צלחת קידוד סטרפטבידין עם חיץ דילול במשך 15 דקות.

לאחר שטיפת הצלחת, יש לוודא שהיא יבשה. לאחר מכן להעביר את הנפח הכולל של המדגם משתי הצלחות ל בארות בודדות של צלחת מקודד סטרפטבידין ולהדגיר אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ לשטוף.

הוסף 100 microliters של עכבר נגד עכבר Cd4d3+4 IgG ולדגור את הצלחת במשך שעה נוספת. חזור על השטיפה. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של פוספטאז אלקליין נגד עכברים ומשאירים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן לשטוף את בארות שלוש פעמים עם חיץ לשטוף ופעם אחת עם חיץ דילול. הכן p-nitrophenyl פוספט במיליגרם אחד למיליליטר במאגר אתנולאמין צבע ולהוסיף 100 microliters לכל באר. לאחר דגירה של 15 דקות, למדוד את הספיגה יש כל באר ב 405 ננומטר.

השתמש בדילול המינימלי שבו אין אות על הצלחת כגורם הדילול המתאים כדי ליצור tetramers. דגירה סטרפטבידין-PE ודילול החלבון הביוטינילציה המתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לאחסן חלבונים מוגנים בצינור מוגן באור בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

לסובב את הצינורות חרוט עם דגימות מטופלים ושליטה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי והקפיא את אחד הצינורות במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. להשעות מחדש את גלולה בצינור השני ב 10 מיליליטר של PBS עם 1%BSA ולהניח בצד 100 microliters של תאים כפקד שלילי על צלחת 96 באר.

לאחר מכן מוסיפים את החלבון הרקומביננטי הטרום-משותף לתליית התא בצינור חרוט ובצלחת 96 הבאר. בצע כתמי תאים במשך שעה אחת לפחות בארבע מעלות צלזיוס על רוטור ספסל עם סיבוב עדין. ואז גלולה את התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant.

לאחר שטיפת התאים פעמיים, להשעות אותם מחדש בחמישה מיליליטר של PBS. מסננים את התאים דרך מסננת של 30 מיקרומטר כדי להסיר אשכולות תאים. ואז לנתח אותם עם זרימה סודור.

השתמש בדגימה של פקד שלילי לשער עבור תאים שליליים חיוביים BFP ו PE. לאחר מכן למיין את המדגם ולאסוף 500, 000 כדי 1 מיליון BFP חיובי תאים שליליים PE לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הכלוב הכואב יהיה תלוי בקשירת התאים לחלבון, אך בדרך כלל נאספים אחד עד 5% מהדגימות השליליות PE.

עכשיו תן לתאים ממוינים על ידי צנטריפוגה במשך 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant. גלולה ניתן לאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שישה חודשים. השתמש בפונקציית הספירה של קסם כדי למפות רצפים מהאוכלוסייה הלא ממוינת והמיוינת לספריית הייחוס, שתניב קובץ ספירה גולמי.

הפעל את פונקציית הבדיקה של קסם באמצעות ספירות גולמיות מדגם הבקרה הלא ממוין כפקד ואת הספירות מהדגימה ממוינת כטיפול. פתח את קובץ סיכום הגנים שנוצר ודרג את עמודת דירוג ההשהיה בסדר עולה. לאחר מכן זהה כניסות עם קצב גילוי כוזב של פחות מנקודה 0.05.

הקולטן מדורג בדרך כלל לעתים קרובות מאוד בעמדה הראשונה. לבסוף להשתמש R או תוכנה שוות ערך כדי להתוות את הציון אלגוריתם דירוג חזק לבחירה חיובית. מסכי הפלה בסולם הגנום לזיהוי השותף המחייב של TNFSF9 ו- P falciparum האנושי או H5 של TNFSF9 ו- P falciparum Rh5 האנושיים בוצעו בתאי NCI-SNU-1 ו- HEC-293 בהתאמה.

התנהגות מחייבת של Rh5 הושפע הן heparan סולפט וזה ידוע קולטן BSG ואילו TN-FRSF-9 לא לאבד קשירה לקולטן הידוע שלה TN-FSF-9. עם הדגירה מראש עם הפרין מסיס. הפצת GNA בספריית מוטנט הבקרה גילתה כי מורכבות הספרייה נשמרה לאורך כל הניסוי.

האיכות הטכנית של המסכים הוערכה על ידי בחינת התפלגות שינויי הקיפול שנצפו של G-RNA המכוונים לקבוצה ייחוס של גנים לא חיוניים, בהשוואה להפצה עבור קבוצת ייחוס של גנים חיוניים. בנוסף, העשרה ברמת המסלול גילתה כי מסלולים חיוניים צפויים זוהו והועשרו באופן משמעותי באוכלוסיית הנשירה. בעת השוואת דוגמת הפקד לספריית הפלסמיד המקורית.

אלגוריתם הדירוג החזק או ציון ה-RRA מספק מדד שבו G-RNA של מדורגים באופן עקבי גבוה מהצפוי. במסך עבור TNFRSF9, הלהיט העליון היה TNFSF9, שהוא שותף איגוד ידוע. בנוסף, זוהו גם מספר גנים הקשורים למסלול TP53.

במקרה של RH5, בנוסף לקולטן הידוע, והגן הנדרש לייצור בדיחות זועפות, זוהה גם הגן SLC16A1. גישת ההקרנה היא בדרך כלל חזקה מאוד ואת הקולטן אינטראקציה ישירה צריך להיות מדורג מאוד ברשימת הגנים מועשר בסדר זה של האוכלוסייה. זה חיוני כדי לאמת את הלהיטים המתקבלים מהמסך.

אם האינטראקציה מתווכית על ידי חלבונים, גישות ביוכימיות שנועדו לחקור אינטראקציות חלבון חלבון בינארי, למשל, יכול לשמש למחקרי אימות נוספים. בגלל האופי הלא משוחד של סולם הגנום של גישה זו, אנו צופים כי היא תסייע לחקור את האינטראקציות המתווכוות על ידי מולקולות תאים קשות לחקר כגון שומנים, חלבוני קרום multipass וגליקנים. זה עשוי גם לחשוף מסלולים חדשניים הנדרשים לסחר לקולטן וביולוגיה.