מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית
22 במאי 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
הבדיקה מבוססת התאים מאפשרת תצפית וכימות של אינטראקציות הידבקות טרנס ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. למרות שאינטראקציות החלבון שנבדקו כאן רלוונטיות לנוירוביולוגיה, ניתן ליישם שיטה זו בכל תחום מחקר שבו הידבקות חלבון מתרחשת בין-תאית. 48 שעות לאחר העברת תאי HEK-293T, קצרו את התאים מצלחת שש הבארות לצבירה.
ראשית, יש לשטוף כל באר פעמיים עם PBS. לאחר מכן, כדי לנתק בעדינות את התאים, הוסף מיליליטר אחד של 10 מילי-מולרי EDTA לכל באר, ולאחר מכן דגר על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות של דגירה, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים ולקצור כל באר לצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר.
צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בזמן שהתאים מתגלגלים, הכינו שישה צינורות דגירה על ידי סימון החלק העליון של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בתנאי הניסוי. יש להשתמש בכל תמורות של GFP ו-mCherry .
הסר את הסופרנטנט מהצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר והשהה מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום. בעזרת המוציטומטר ספרו את התאים בכל צינור חרוטי. לאחר מכן יש להוציא 200,000 תאים מכל מצב לתוך צינור הדגירה המתאים לתערובת אחד לאחד בנפח כולל של 500 מיקרוליטר.
לאחר הערכת הצבירה הבסיסית המתוארת בסעיף הבא, הנח את צינורות הדגירה במסובב צינור איטי בטמפרטורת החדר. כדי להעריך את הצבירה, בנקודת ההתחלה ושוב לאחר 60 דקות, פיפטה 40 מיקרוליטר מצינור הדגירה על שקופית מיקרוסקופ טעונה. רכישה בסיסית צריכה להיעשות במהירות האפשרית לאחר הוספת תאים לצינור המיקרו-צנטריפוגה.
דמיין את השקופית תחת פלואורסצנטיות בערוץ הירוק והאדום. עבור כל שקופית, צלם תמונות של שלושה שדות ראייה שונים במישור מוקד אחד. תאי HEK-293T הועברו עם חלבון מעניין, חלבון מוטנטי מעניין, או ליגנד מעניין ועברו טרנספקט משותף עם חלבון פלואורסצנטי.
אוכלוסיות תאים המבטאות את החלבון המעניין עורבבו עם אוכלוסיות תאים המבטאות את הליגנד המעניין והוערכו לצבירה לאחר 60 דקות. בשכבות-על של תמונות שצולמו בערוצים הירוקים והאדומים, הצבירה מופיעה כפונקטה צהובה. מצבים שבהם תאים לא ביטאו ליגנדים סינפטיים הראו צבירה מינימלית.
כמו כן, צבירה מינימלית הוצגה כאשר רק אחת משתי האוכלוסיות ביטאה ליגנדים סינפטיים. לא הוצגה צבירה כאשר שתי אוכלוסיות התאים ביטאו מולקולות הידבקות לא תואמות. תנאים עם מולקולות הידבקות תואמות הראו צבירה משמעותית לאחר דגירה של 60 דקות.
באופן מפתיע, החלבון המוטנטי המעניין הפגין צבירה משמעותית יותר מאשר מקבילו מסוג הבר, מה שמרמז על כך שהמוטציה הנקודתית משפרת את יכולות קשירת החלבונים. מוטציות במולקולות הידבקות רבות קשורות בדרך כלל להפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירו-פסיכיאטריות והתמכרות. בעזרת טכניקה זו, ניתן לסנן את ההשפעות של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלה על אינטראקציות טרנס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול מותאם למדידה מהירה וחצי-כמותית של אינטראקציות ליגנד-רספטור ב-trans, באמצעות גישה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתאי HEK-293T. שיטה זו מאפשרת כימות של אינטראקציות היצמדות של חלבונים הרלוונטיות לנוירוביולוגיה ולתחומי מחקר פוטנציאליים אחרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נוירוביולוגיה
- היצמדות תאים
- אינטראקציות בין חלבונים
רקע
- אינטראקציות בין ליגנד לרצפטור הן קריטיות לתקשורת תאית.
- הבנת אינטראקציות אלו מסייעת להבהרת המנגנונים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות.
- שיטות מסורתיות עשויות לדרוש טיהור נרחב של חלבונים או ציוד ייעודי.
- מחקר זה מציע גישה יעילה יותר המשתמשת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהיר ויעיל לחקר היצמדות חלבונים במערך מבוסס תאים.
- הערכה של האופן שבו מוטציות נקודתיות בחלבונים משפיעות על אינטראקציות trans.
- יישום נרחב של שיטה זו במחקרי היצמדות חלבונים מחוץ לתחום הנוירוביולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצילום אינטראקציות בין תאים.
- תאי HEK-293T שימשו כמודל ביולוגי, תוך התמקדות בחלבונים וליגנדים שעברו טרנספקציה.
- לוח הזמנים הניסיוני כלל הערכה של אגרגציה תאית 60 דקות לאחר הטרנספקציה.
- ספירת התאים בוצעה באמצעות המוציטומטר, ולאחריה בוצעו ריסוספנזיה וערבוב של התאים לצורך הצילום.
תוצאות עיקריות
- אגרגציה של תאים המבטאים מולקולות היצמדות תואמות הוגברה באופן משמעותי לאחר 60 דקות.
- חלבונים מוטנטיים הראו אגרגציה גבוהה יותר בהשוואה למקביליהם מסוג הבר (wild-type), דבר המצביע על יכולות קישור משופרות.
- אגרגציה מינימלית נצפתה כאשר אף אחת מהאוכלוסיות, או רק אוכלוסייה אחת מהן, ביטאה ליגנדים סינפטיים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה יעילה להערכת אינטראקציות של היצמדות בין-תאית.
- הממצאים מדגישים את הפוטנציאל של טכניקה זו בחקר השפעותיהן של מוטציות על אינטראקציות בין חלבונים.
- תובנות משיטה זו הן בעלות ערך להבנת המכניזמים העומדים בבסיס הפרעות נוירו-התפתחותיות ופסיכולוגיות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה זו מאפשרת מדידה ישירה של אינטראקציות בין-חלבון מסוג trans בהקשר תאי, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית של בדיקות ביוכימיות שאינן יכולות להבחין בין קישור מסוג cis לבין קישור מסוג trans. על ידי כימות של הידבקות בין-תאית רלוונטית פיזיולוגית בלבד, השיטה משפרת את רמת הוודאות של תיקוף המטרה ומפחיתה את כמות התוצאות החיוביות השגויות בשלבי הגילוי המוקדמים. היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות הידבקות המעורבות בהפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מדידת היצמדות (adhesion) תפקודית בין זוגות של ליגנד ורספטור המובעים בתאים נפרדים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בטיהור חלבונים, ובכך מאפשר סריקה מהירה של מוטציות או וריאנטים ישירות במערכת תאית.
- ערך ניבוי: אגרגציה מוגברת עם מוטציה הקשורה למחלה מדגימה כיצד הבדיקה יכולה לזהות וריאנטים מסוג gain-of-function לצורך תיעדוף.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: שימוש בתאי HEK המסומנים פלואורסצנטית ליצירת תוצרי הדמיה כמותיים (למשל, נקודות צהובות בחפיפה) לצורך התאמה לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
- שחזוריות: תנאי ערבוב ודגירה סטנדרטיים של התאים מאפשרים מדידות עקביות של אגרגציה בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה (Scalability): הפרוטוקול תומך בבדיקה של מספר תנאים במקביל (למשל, סוג ברי/wild-type לעומת מוטנט, שילובי ליגנדים) באמצעות שלבי ערבוב והדמיה פשוטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: בודק באופן ישיר כיצד מוטציות נקודתיות במולקולות היצמדות — הנפוצות בהפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירו-פסיכיאטריות ובהפרעות התמכרות — משפיעות על אינטראקציות trans.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין בדיקות קישור in vitro לפנוטיפים תאיים, ותומך בהחלטות go/no-go המבוססות על נתוני היצמדות פונקציונליים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מזהה אם מוטציות מחזקות או משבשות קישור בין-תאי, ובכך מספק מידע על מנגנון המטרה ופרופיל הבטיחות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת בין סריקת מעורבות במטרה (target engagement) לבין תיקוף תפקודי, ומספקת נתונים ספציפיים להיצמדות כדי להנחות את אופטימיזציית המולקולות המובילות ואת בחירת המועמדים הפרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: בודק האם וריאנטים גנטיים משנים היצמדות בין-תאית, ובכך תומך בהבהרת מסלולים ובתיקוף השערות לגבי מטרות טיפוליות.
- אנליטיקה: מייצר תוצאות כמותיות מבוססות דימות (היווצרות אגרגטים לאורך זמן) להשוואה בין תנאים ולהערכת חוזק האינטראקציה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים מולקולריים לפנוטיפים תאיים הרלוונטיים ליצירת סינפסים וקישוריות עצבית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לכל מערכת של היצמדות חלבונים בין-תאית, מה שהופך אותה לפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר במגוון תחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מודד אך ורק אינטראקציות trans, ובכך מפחית את הערכת היתר של הקישור הנצפית במבחנים המבוססים על ליזט ומשפר את הספציפיות למטרה.
- ערך תפעולי: משתמש בתרביות תאים סטנדרטיות ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ללא צורך בציוד מיוחד או בריאגנטים מורכבים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכה מהירה של השפעות מוטציות על תפקוד המטרה, ובכך תומך בקבלת החלטות go/no-go טובות יותר בזיהוי מובילים (leads).
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי וריאנטים עם הדבקה (adhesion) משונה שעשויים להשפיע על היעילות או הרעילות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנספקציה של תאי יונקים, תיוג בחלבון פלואורסצנטי, וציטומטריית זרימה או ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.
- תלוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם יכולת דימוי דו-ערוצית (למשל, GFP ו-mCherry) ובכלי ניתוח תמונות לכימות אגרגטים.
- נדרשת סטנדרטיזציה של רמות הביטוי בתאים ויחסי ערבוב כדי להבטיח תוצאות אגרגציה הניתנות לשחזור בין צוותים שונים.
- הסתגלות למערכות שאינן HEK עשויה לדרוש אופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה ושל ביטוי מולקולות היצמדות על פני השטח.
- מוגבל להערכת היצמדות; אינו מדווח על סיגנלינג במורד המסלול או על אירועי הפנמה לאחר הקישור.
