אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus
24 במאי 2020
פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.
טכניקות מיקרו-הזרקה של עוברים סללו את הדרך לפיתוח כלים רבים לבקרת וקטורים מבוססי גנטיקה. למרות שלמיני חרקים רבים יש פרוטוקולים שכבר מפותחים היטב, Culex quinquefasciatus נותר יחסית לא נחקר. פרוטוקול מיקרו-הזרקה זה תוכנן במיוחד כדי להתאים לתכונות הביולוגיות הייחודיות של Culex quinquefasciatus, כולל איסוף ביציות, הפרדת רפסודת ביצים והליכים לאחר ההזרקה.
סביר להניח שניתן להתאים שיטה זו לכל מין קולקס מעניין, וניתן להשתמש בה כדי לחקור את תפקוד הגנים או ליצור טכנולוגיות בקרה מבוססות גנטית עבור מיני קולקס. התחל בהפרדת הביצים מהרפסודות. השתמש במלקחיים או במכחול כדי ללחוץ כלפי מטה על הרפסודה ולהפריד את הביצים הבודדות.
יישר את הביצים על רצועה דקה של סרט דביק דו צדדי המונח על החלק העליון של שקופית זכוכית, תוך מאמץ לכוון את הצד הקדמי של כל ביצה לאותו כיוון. מכינים את תערובת ההלו-פחמן על ידי ערבוב עדין של ריאגנטים של הלוקרבון עם מים, ודגירה של התערובת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מכסים ביצים מיושרות בתערובת שמן הלוקרבון.
כדי ליצור מחטים למיקרו-הזרקות הנח זכוכית נימית אלומינוסיליקט לתוך מושך מחט, בהתאם להוראות היצרן. הגדר את החום ל-560, המהירות ל-100, ההשהיה ל-70, המשיכה ל-97 והלחץ ל-500. לאחר מכן הפעל את חולץ המחט.
גע בעדינות בקצה המחט הנמשכת על צלחת שוחקת היהלום המסתובבת למשך כ-10 שניות בזווית של 50 מעלות כדי לשפע את קצה המחט. הטמיעו מחטים משוכות ומשופעות לשורות של חימר של מודלים בצלחת פטרי. הכן את תערובת ההזרקה המורכבת מריאגנטים לשינוי גנום ואחסן אותה על קרח.
השתמש בקצה מיקרו-טוען כדי לטעון שני מיקרוליטר של תערובת הזרקה לתוך מחט ההזרקה. הנח את מחט ההזרקה המלאה לתוך מיקרומניפולטור המקושר למיקרו-מזרק אלקטרוני והנח את מגלשת הזכוכית עם הביצים המיושרות על הבמה של מיקרוסקופ מורכב. בעזרת המיקרומניפולטור, יישר את המחט כדי לכוון לקצה האחורי של העובר בזווית של 25 עד 35 מעלות.
הכניסו בזהירות את המחט לעובר והזריקו את התערובת בכמות של כ-10% מנפח העובר. להזריק 20 ביציות בכל פעם, ואז לעצור ולבצע הליכי התאוששות עוברים. תוך 20 דקות לאחר ההזרקה, הסר בזהירות את שמן הלוקרבון מהביצים על ידי הברשה קלה בעזרת מברשת נקייה.
מרימים את הביצים בעזרת המכחול ומניחים אותן בכוס מים מזוקקים כפולים, תוך הקפדה על שמירת הביצים על פני השטח. במהלך שבעת הימים הבאים, בדוק את הביצים מדי יום לבקיעה ופעל לפי נהלי גידול זחלים רגילים. סנן את היתושים המוזרקים עבור הפנוטיפים המוטנטיים באמצעות סטריאוסקופ.
שיטה זו שימשה ליצירת מוטציות סומטיות ומוטציות נבט של גן קריטי להתפתחות פיגמנטציה של עיניים כהות. מוטציות סומטיות שנוצרו על ידי CRISPR-Cas9 נמדדו על ידי בדיקת אובדן פיגמנטציה בעיני שלב האישון של אנשים שהוזרקו. מוטציות סומטיות היו קיימות בדרך כלל כפנוטיפים של פסיפס, כאשר לחלק מהתאים אך לא לכולם יש את הפנוטיפ המוטנטי.
שיעורי המוטציות בקו הנבט נקבעו על ידי הכלאה של פסיפס G אפס פרטים וניקוד לכל צאצא לבן עיניים לחלוטין. ניסויים אלה הביאו לשיעור הישרדות עוברי של 64 עד 82%, שיעור מוטגנזה סומטי של 37 עד 57% ושיעור מוטגנזה של יותר מ-61%. על ידי ריבוב sgRNAs כדי להתמקד במספר מיקומים באותו גן, שיעורי המוטגנזה הסומטיים והנבט עלו עד 86%בנוסף, במשך דורות רבים, מלאי הומוזיגוטי בר קיימא של המוטאנטים הלבנים נשמר בהצלחה במעבדה.
כדי לייעל את שיעורי ההישרדות והמוטגנזה, יש להכין כראוי את כל החומרים, כולל שמן הלופחמן, נוזל הזרקה ומחטים, לפני ניסיון מיקרו-הזרקה. זה יאפשר תהליך מיקרו-הזרקה יעיל וממוקד יותר.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט טכניקות של מיקרו-הזרקה לעוברי Culex quinquefasciatus, אשר עברו אופטימיזציה עבור עריכה גנטית באמצעות CRISPR/Cas9. הוא מאפשר יצירה יעילה של מוטציות תורשתיות בקו הנבטים למטרות מחקר גנטי וטכנולוגיות לבקרת וקטורים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה של וקטורים
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9
רקע
- Culex quinquefasciatus הוא וקטור למחלות שאינו נחקר מספיק.
- טכניקות של מיקרו-הזרקה הן קריטיות לפיתוח כלים לבקרה גנטית.
- פרוטוקולים קיימים עבור מיני חרקים אחרים מבוססים היטב.
- שיטה זו מותאמת למאפיינים הביולוגיים הייחודיים של מיני Culex.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מיקרו-הזרקה עבור Culex quinquefasciatus.
- סיוע במחקרי תפקוד גנים ובטכנולוגיות בקרה גנטית.
- אופטימיזציה של שיעורי ההישרדות והמוטגנזה בעוברים מוזרקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות לאיסוף ביצים ולהפרדת רצפות.
- הכנת שמן הלוקרבון ותערובת ההזרקה.
- מיקרוהזרקה לעוברים באמצעות מיקרומניפולטור.
- סריקה לאיתור פנוטיפים מוטנטיים לאחר ההזרקה.
תוצאות עיקריות
- הושג שיעור הישרדות של העברים של 64-82%.
- שיעורי מוטגנזה סומטית נעו בין 37-57%.
- שיעורי מוטגנזה בקו הנבטתי עלו על 61%.
- שימוש במערכי sgRNAs מרובים (Multiplexing) העלה את שיעורי המוטגנזה ל-86%.
מסקנות
- הפרוטוקול מייצר בהצלחה מוטציות סומטיות ומוטציות בקו הנבט.
- במעבדה שומרו מאגרים הומוזיגוטים בריאים של מוטנטים.
- הכנה נאותה של החומרים משפרת את תהליך המיקרו-הזרקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרו-הזרקה יעילה של עובריים מאפשרת מוטגנזה ספציפית לאתר ב-Culex quinquefasciatus, וקטור מרכזי למחלות כגון נגיף ניל המערבי ופילריה לימפטית. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי יצירת מוטציות תורשתיות למחקרי תפקוד גנים. הפרוטוקול נותן מענה למחסומים ספציפיים למין, ובכך משפר את רמת הביטחון בחיזוי בזיהוי מטרות לבקרת וקטורים ובפיתוח מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השתקה (knockout) מדויקת של גנים בתוך וקטור חרקים הרלוונטי למחלה.
- ערך תפעולי: מספק שיטה הדירה ליצירת מוטציות בקו הנבט לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות בהעברת פתוגנים.
- ערך ניבוי: תומך במיון ותיעדוף של תיקי פיתוח על ידי קישור שיבוש גני לתוצאות פנוטיפיות הקריטיות למסוגלות הוקטורית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות מוטגנזה כמותיות (שיעורי מוטגנזה סומטית וגרמינלית) להערכת יעילות העריכה בין תכנוני guide RNA שונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הטיפול בעובריים ותנאי ההזרקה, מה שמשפר את השחזוריות של הבדיקה בין סדרות ניסויים.
- יכולת הרחבה: מאפשר הובלה של sgRNA מרובה (multiplexed) להגברת שיעורי המוטגנזה, ובכך תומך בסריקת מטרות בעלת תפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: יצירת מוטנטים בעלי עיניים לבנות הניתנים להורשה, לצורך ביסוס קווים גנטיים יציבים למחקרי פנוטיפ והעברה ארוכי טווח.
- ערך תפעולי: השגת שיעורי הישרדות של עוברים בטווח של 64–82%, המבטיחים מספיק מוטנטים בריאים לסריקות פנוטיפיות בהמשך התהליך.
- המשכיות תרגומית: שמירה על מאגרי מוטנטים הומוזיגוטים בריאים לאורך דורות, התומכת בהערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות בקרה גנטית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מהשערת המטרה ועד לזיהוי מוביל, על ידי אפשור גנומיקה תפקודית במין וקטור שאינו נחקר דיו.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת השערות באמצעות מוטגנזה מתווכת CRISPR/Cas9 להבהרת תפקוד גנים באינטראקציות בין פתוגן לווקטור.
- סריקה: מספק שיעורי מוטגנזה כמותיים (37–57% סומטי, >61% גרמנליין) להשוואת יעילות ה-guide RNA ואופטימיזציה של תנאי העריכה.
- אנליטיקה: מאפשר דירוג של פנוטיפים מוטנטיים באמצעות סריקה סטריאוסקופית, המספקת תוצרים מדידים לתיקוף פגיעות (hit validation).
- מחקר תרגומי: מקל על הרצף מגילוי גנים לפיתוח מודלים פרה-קליניים על ידי יצירת קווי מוטנטים יציבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית של מיקרו-הזרקה הניתנת להתאמה בין מיני Culex, ובכך מפחית פיתוח כפול של פרוטוקולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אפשור קישור ישיר בין גנוטיפ לפנוטיפ במודל של מחלה המועברת על ידי וקטור.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות יישור ביצים סטנדרטי, כיסוי של halocarbon ושלבי הכנת המחט.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת תיקוף תפקודי של מטרות החיוניות להישרדות הוקטור או להעברת הפתוגן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על שיעורי מוטציות תורשתיות וחומרת הפנוטיפ.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברים, מיקרו-מניפולציה וסריקה פלואורסצנטית או סטריאוסקופית.
- תלוי במכשיר לשבירת מחטים (needle puller), מיקרו-מזרק והכנת שמן הלוקרבון להבטחת חיוניות העוברים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לטכניקות של איסוף ביצים והפרדת רפסובי ביצים.
- התאמה בין מיני Culex עשויה לדרוש התאמות בנפח ההזרקה ובגיאומטריה של המחט.
- מגבלות מעשיות כוללות את שבריריות העוברים ואת הצורך בהתאוששות מיידית לאחר ההזרקה כדי לשמר את שיעורי ההישרדות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
