גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד
2 בנובמבר 2020
נייר זה מציג שיטות לגידול מיוציטים לבביים עם צורות שונות, המייצגות פתולוגיות שונות, ומיון מיוציטים לביים דבקים אלה בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת תא אחד. הפלטפורמה המוצעת מספקת גישה חדשנית לתפוקה גבוהה והקרנת סמים עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.
אנו מציעים פלטפורמה חדשנית לחקירת ההשפעות של צורת התא על ביטוי גנים, תוך שימוש בשיטות לגידול ומיון דבקויות עם מורפולוגיות שונות ברמת התא הבודד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מחקר תפוקה גבוהה של צורת התא במבחנה כמו השוואת תאים עם צורות שונות ב vivo הוא תובעני מבחינה טכנית. כדי להקים תרבות cardiomyocyte בדוגמת, להעביר השעיה cardiomyocyte ביחס גובה-רוחב של עניין צינור 15 מיליליטר לספירה ולדלל את התאים ל 10 פעמים עד חמשת התאים למיליליטר של ריכוז בינוני ציפוי מתאים.
הוסיפו שני מיליליטר תאים לשבב מיקרו-פטרוני מצופה פיברונקטין שקוע בשני מיליליטר של מדיום ציפוי חם בתוך צלחת גרנייה פטרי 35 מיליליטר והניחו את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 18 שעות. למחרת, בדוק את השבב על ידי מיקרוסקופ אור כדי לאשר שרוב התאים מחוברים. מוציאים את המדיום מהצלחת כדי להסיר את כל הפסולת או התאים המתים, ומתחילים מהמרכז ומתקדם לכיוון הצדדים בצורה טיפה חכם, בעדינות להוסיף PBS לתאים.
לאחר הכביסה השלישית, החלף את ה- PBS במדיום תחזוקה של ארבעה מיליליטר והחזר את התאים לאנקובטור תרבות התאים. לאחר 72 שעות, יש לשטוף בעדינות את משטח השבב פעמיים עם שני מיליליטר של PBS חם של Dulbecco לכל שטיפה כפי שהוכח ולהשתמש במטליות כדי להעביר מיד את השבב השטף למנה סטרילית חדשה של 35 מיליליטר גרנייה פטרי. הוסף במהירות 1.5 מיקרוליטרים של ירוק דיסיקל תוסס מדולל 1000 לקפל DPBS לשבב.
מתקנים תא מעל השבב ומ מניחים את המנה על מחזיק הכלים של שלב בורר התאים. הכנס את המכסה המגנטי ואתר את הכוונת בחלון התצוגה החיה. התמקד בצלב, ובחלון הסריקה והמיון, בחר את הכיול להזרקה וכיול אוטומטיים.
החלף את המנה supernatant עם 1.5 מיליליטר של E משולש אחד לאחד בפתרון DPBS כדי לשחרר את התאים מן fibronectin ולפתוח את לשונית הסריקה. כדי לסרוק את השבב כולו, התמקד בפינה השמאלית העליונה של השבב בשדה התצוגה ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי. לאחר מכן, התמקד בפינה השמאלית התחתונה של השבב ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי.
בחלון המוקפץ, לחץ על הגדר את המישור החד ביותר ולחץ על מעבר לפינה השמאלית העליונה ולעבור ללחצני הפינה הימנית התחתונה. לאחר מכן, לחץ על סיום כדי להתחיל בסריקה. לאחר השלמת הסריקה, פתח את הכרטיסיה ניתוח ולחץ על הצג מפה כדי לבחור את התאים הבודדים העוברים את קריטריוני המחקר.
מרכז את מיקרו-הכיפה של הזכוכית באמצע הנוף החי של המיקרוסקופ ופתח את לשונית המשאבה. כדי ליצור ואקום, לסגת הבוכנה מ 50 מיליליטר מספר אחד מזרק ארבעה מיליליטר ולפתוח את לשונית המיון. כדי לאפשר תא בודד להיאסף, הגדר את השסתום 2 להיפתח במשך 120 אלפיות שנייה ושסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 200 אלפיות שנייה.
כדי לאפשר את התא הרים להישלח בהצלחה לצינור PCR שלה המכיל מאגר תזה, להגדיר את השסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה שסתום שתיים להיפתח במשך 10 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 10 אלפיות השניה. לאחר התאמת הגדרות השסתום, לחץ על מ לחשב את הנתיב. התוכנה ת לחשב את הנתיב המהיר ביותר מתא לתא להרים והזרקת התאים שנבחרו לאורך השבב.
לאחר מכן, למקד את המיקרוסקופ על דפוס על פני השטח של השבב. השתמשו בהיגוי כדי להזיז את המיקרו-אקפילארי כלפי מטה בזהירות, כך שניתן יהיה להשיג את התמונה החדה ביותר של קצה המיקרו-אקפילארי מבלי לגעת במשטח השבב וללחוץ על סט. ייפתח חלון חדש, המציג את חתך המיקרו-אקפילארי.
כדי שהתוכנה תקליט את היסט הקצה של נימי הקואורדינטות X, Y ו- Z, לחץ על המרכז המדויק של נימי. לאחר מכן, לחץ על התחל למיין כדי להפעיל את המיון. בניתוח מייצג זה של cDNA מוגבר מראש מתא בודד הרים, רצועה ברורה בג'ל כמו עלילה densitometry נצפתה המתאימה לשיא ב 1, 852 זוגות בסיס ב electropherogram.
הגודל הממוצע של שברים היה 1, 588 זוגות בסיס עם מספר קטן של שברים שהיו קצרים יותר מ 300 זוגות בסיס, המציין את הדור של ספריית cDNA טובה. כתמים וניתוח Immunofluorescent יכול להתבצע גם כדי להעריך את מבנה sarcomere בתוך cardiomyocytes בדוגמת. פלטפורמה זו סוללת את הדרך לחקר תפוקה גבוהה הקרנת סמים של סוגים שונים של אי ספיקת לב.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמה חדשנית לגידול ומיון של מיוציטים לבביים (cardiac myocytes) בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת סריקת תרופות בעלת תפוקה גבוהה עבור סוגים שונים של אי-ספיקת לב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית של מיוציטים קרדיאליים
- ניתוח מורפולוגיה של תאים
- מתודולוגיות לסריקת תרופות
רקע
- מיוציטים של שריר הלב מציגים צורות מגוונות המתואמות עם פתולוגיות שונות.
- חקירת השפעות צורת התא על ביטוי גנים היא מאתגרת in vivo.
- טכניקות של תפוקה גבוהה חיוניות לסריקת תרופות יעילה.
- שיטות נוכחיות חסרות יעילות במיון ובניתוח של תאים בודדים על בסיס מורפולוגיה.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה לבדיקת השפעת צורת התא על ביטוי גנים.
- סיוע במיון של מיוציטים לבביים (cardiac myocytes) על בסיס המורפולוגיה שלהם.
- שיפור תהליכי סריקת תרופות לטיפול באי-ספיקת לב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה ודילול של תרחיף קרדיומיוציטים.
- שימוש בשבבים עם תבניות מיקרוסקופיות מצופים בפיברונקטין לתרבית תאים.
- מיקרוסקופיה של אור לאישור היצמדות התאים.
- סריקה ומיון אוטומטיים של תאים בודדים באמצעות מערכת מיקרו-קפילרית.
תוצאות עיקריות
- הצמדה ותחזוקה מוצלחת של קרדיומיוציטים במבנה תבניתי.
- יצירה של ספריית cDNA איכותית מתאים של תאים בודדים שעברו מיון.
- צביעה אימונופלואורסצנטית חשפה מבני סרקומר.
- הפלטפורמה תומכת במחקרים בעלי תפוקה גבוהה ובסריקת תרופות.
מסקנות
- הפלטפורמה שפותחה מציעה גישה חדשנית לחקר מיוציטים של הלב.
- היא מאפשרת מיון וניתוח יעילים של תאים על בסיס מורפולוגיה.
- שיטה זו עשויה לקדם משמעותית את המחקר בתרפיות לאי-ספיקת לב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
פלטפורמה זו מאפשרת חקירה שיטתית של האופן שבו מורפולוגיית המיוציטים בלב משפיעה על ביטוי גנים, ובכך היא נותנת מענה לפער קריטי בהבנת הוויסות התעתיתי התלוי-צורה באי-ספיקת לב. על ידי קישור מורפוטייפים גיאומטריים מוגדרים לפנוטיפים פתולוגיים, כגון קרדיומיופתיה היפרטרופית ודילטטיבית, היא מספקת גשר מכניסטי בין המבנה התאי לבין סיגנלינג הרלוונטי למחלה. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובסריקה פנוטיפית, באמצעות יצירת נתונים תעתיתיים של תאי-בודד (single-cell) הניתנים לשחזור ומסווגים לפי מורפולוגיה, במטרה להפחית סיכונים בהשערות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות קורלציה בין יחסי גובה-רוחב ספציפיים של קרדיומיוציטים לבין פרופילי ביטוי גנים הקשורים לרימודללינג פתולוגי.
- ערך תפעולי: מקל על הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות בידוד תאים בודדים ופרופיל טרנסקריפטומי תחת בקרה מורפולוגית וסטנדרטיזציה.
- ערך חיזוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי חתימות מולקולריות תלויות-צורה שעשויות לנבא את יעילות התרכובת בתתי-סוגים שונים של אי-ספיקת לב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות עם יחסי גובה-רוחב מדויקים לצורך סריקת תרכובות בהמשך במודלים של אי-ספיקת לב.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה ויכולת שחזור של הבדיקה באמצעות שבבי פיברונקטין עם תבניות מיקרוסקופיות, המכפים מורפולוגיה תאית עקבית בין חזרות.
- מדרגיות: תמיכה בסריקה בשקיפות גבוהה באמצעות בחירה אוטומטית של תאים בודדים והזרקתם למסלק ליסיס לצורך עיבוד מקבילי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין טרנסקריפטומיקה מרובת-שכבות מורפולוגיות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני, באמצעות מידול גאומטריות הקשורות ל-HCM ו-DCM.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: מאפשר זיהוי של חתימות טרנסקריפטומיות תלויות-צורה שעשויות לשמש כאינדיקטורים ניבויים לתגובה לטיפול.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי חשיפת האופן שבו צורת התא מווסתת את הפעלת המסלולים בתגובה להפרעה פרמקולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לניתוח מונחה-השערות של השפעות צורת התא לפני זיהוי המולקולה המובילה, כאשר התוצאים מסייעים בבחירת מודל פרה-קליני ובאסטרטגיות להפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנה צורת התא, כדי להבהיר את תפקידו בבקרה תעתוקית בתנאים נורמליים ופתולוגיים.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות של קרדיומיוציטים המוגדרות מורפולוגית ומוכנות לבדיקה, לצורך הערכה מהימנה של תרכובות בתהליכי גילוי תרופות לאי-ספיקת לב.
- אנליזה: מייצרת מדידות טרנסקריפטומיות כמותיות של תא בודד, המאפשרות השוואה של ביטוי גנים בין מורפוטייפים גיאומטריים שונים.
- מחקר תרגומי: מספקת מידול של מערכות רלוונטיות למחלה, כגון היפרטרופיה קונצנטרית ואקסצנטרית, באמצעות יחסי גובה-רוחב מבוקרים, ובכך משפרת את הרציפות הפרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר עבור קמפיינים של סריקה איטרטיבית על פני פנוטיפים מרובים של אי-ספיקת לב וספריות תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת העמימות באופן שבו מורפולוגיה תאית משפיעה על נתיבי איתות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות תרבית עם דפוסי מיקרו (micropatterned culture) וטיפול אוטומטי בתא בודד.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תגובות ביולוגיות תלויות-צורה, שעשויות להעיד על יכולת תרגום קלינית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות, בהתבסס על השפעותיהן במודלים של קרדיומיוציטים המדורגים לפי מורפולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאי לב, טכניקות של מיקרו-דפוסים (micropatterning) ומערכות למניפולציה של תאים בודדים.
- תלוי בגישה לשבבים בעלי מיקרו-דפוסים מצופים בפיברונקטין, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ובוררי תאים אוטומטיים מבוססי מיקרו-קפילריה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות יחס גובה-רוחב (aspect ratio) ושל סבבי ניתוח טרנסקריפטומיים לצורך פרשנות עקבית.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הפלטפורמה לסוגי תאים אחרים או למודלים של מחלות מעבר למיוציטים של הלב.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך באופטימיזציה של צפיפות התאים וזמני הדגירה כדי להבטיח היצמדות אחידה על פני המיקרו-דפוסים.
