ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

שיטה זו יכולה לשמש להערכה כמותית של התבגרות סרקומר בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC. באמצעות גישה זו מבוססת רזולוציה סופר, ניתן לזהות אפילו שינויים עדינים בארגון sarcomere, אשר אינו אפשרי עם הדמיה קונפוקל קונבנציונאלי. לפחות שלוש שעות לפני השימוש, להפעיל את המיקרוסקופ ולהביא את המדגם לטמפרטורת החדר.

כאשר המיקרוסקופ מוכן, הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר הדמיית PALM ל הבאר של תאים מסומנים והכנס את שקופית התא למחזיק הבמה של המיקרוסקופ. בחר את המטרה 1.57 NA 100X שמן ולהשתמש במצב PALM בתוכנת ההדמיה ולהפעיל את הגדרות TIRF. הגדר את מספר המסגרות ל- 5, 000 עד 10, 000, את כוח הלייזר של UV ל- 0.1% ואת הלייזר 647 ל- 0.2% ואת רמת הרווח ל- 50 עד 100.

לאחר הגדרת כל פרמטרי הרכישה, הפעל את תאורת הלייזר ובחר תא יעד. כדי להשיג תמונה, הגדל את כוח הלייזר של 647 ל- 100% והפחת את הרווח לאפס. להלבין את תא היעד במשך כחמש שניות, ולאחר מכן להגדיל את הרווח ל 50 וליזום את רכישת תמונת PALM.

לשחזור נתוני PALM, בסוף הרכישה, לפתוח את הנתונים ב ImageJ ולפתוח את תוסף סופת רעמים. בחר ניתוח הפעלה בתוסף ופתח את תפריט הגדרת המצלמה. הזן את גודל הפיקסל ואת הרווח האלקטרומגנטי.

בתפריט ניתוח הריצה, הגדר את סדר ה- B-spline לשלושה, את קנה המידה של B-spline לשניים, את סף עוצמת השיא ל- stfwave. f1, רדיוס ההתאמה לשלוש, הסיגמא הראשוני ל-1.6, ההגדלה לחמש, תדירות העדכון ל-50 והשינויים הצדדיים לשניים, ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר השחזור, בחרו סיגמא בתפריט היסטוגרמת העלילה ולהשתמש בכלי המלבן לבחירת אזור מעניין, למעט ממצאים אפשריים. הוסף את אזור העניין למסנן והוסף ואי-ודאות הנמוכה מ- 25 לאזור ערכי הריבית.

בכרטיסיה הסרת כפילויות, הזן סף מרחק של 10 ננומטר. בכרטיסיה מיזוג, הגדר את המרחק המרבי ל- 20, את המסגרות המרביות לכל מולקולה לאפס ואת המסגרות המרביות כבויות לאחת. בכרטיסייה תיקון להיסחף, בחר מתאם צולב והגדר את מספר הפחים וההגדלה לחמישה, ולאחר מכן שמור את תמונת PALM הסופית וייצא את הנתונים שלאחר התהליך.

כדי לנתח את אורך הסרקומר, יבא את תמונת PALM המשוחזרת המשוחזרת של עניין ל- ImageJ ולהשתמש בכלי הקו כדי למתוח קו בין מבני הסרקומר שנבחרו בניצב לדיסק Z כדי למדוד את המרחק הקצר ביותר בין תריסי actin. בתפריט הניתוח, בחר פרופיל התוויה והרכוש את האורך בין שתי הפסגות. כדי לנתח את עובי דיסק Z, המר את תמונת PALM המשוחזרת לתמונה במצב שמונה סיביות ופתח את תוסף זיהוי הרכס.

הגדר את רוחב הקו ל- 20, את החדות הגבוהה ל- 230, את החדות הנמוכה ל- 10, את הסיגמא ל- 0.79, את הסף התחתון ל- 25.84 ואת אורך השורה המינימלי ל- 20. בחר רוחב הערכה, הרחב קו והצג תוצאות ולאחר מכן לחץ על אישור ולהשתמש ברוחב הקו הממוצע מטבלת התוצאות לצורך ניתוח נוסף. תאי קרדיומיוציט יילודים שמקורם ב-iPSC מפגינים תבנית אלפא אקטינין דומה עם מבני סרקומרים לא סדירים שאינם מנומקים.

הערכה כמותית מראה כי האורך והעובי של תווי אלפא actinin הם כמעט זהים בין שתי קבוצות של תאים המציין מצב התפתחותי מוקדם של cardiomyocytes נגזר iPSC. לעומת זאת, קרדיומיוציטים בוגרים מציגים רשת סרקומרים רגילה עם אורך סרקומר מעט מוגבר ועובי Z-דיסק מופחת. השוואה של הדמיה קונפוקל קונבנציונלי PALM מגלה שום הבדל משמעותי באורך sarcomere.

עם זאת, עובי עמוק מופחת Z-דיסק מזוהה כאשר קרדיומיוציטים iPSC כפופים הדמיה PALM. רווח ברזולוציה נצפית בעת החלת PALM, הנתמכת על-ידי החלקות העוצמה המתאימות. יש לציין כי מבני סרקומר שנרכשו באמצעות מאגר באיכות נמוכה נראים עבים יותר בהשוואה למבנים שנתפסו בתנאי הדמיה אופטימליים.

חוסר דיוק נתונים זה נובע מהמאפיינים המהבהבים המופחתים של הפלואורופור, וכתוצאה מכך פחות פוטונים שזוהו לכל אירוע לוקליזציה. יתר על כן, דיוק לוקליזציה הוא ירד, הפחתת הרזולוציה הכוללת של תמונת PALM משוחזר. בנוסף, סחף מדגם יכול להשפיע על לוקליזציה מדויקת של מולקולות פלואורסצנטי וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות.

כדי לרכוש תמונות PALM נאותה, חשוב מאוד לאפשר שיווי משקל תרמי של מערכת ההדמיה כולה, כדי למנוע סחף מדגם מוגזם במהלך הדמיה. בעקבות הליך זה, מבנים תאיים אחרים כגון המיטוכונדריה ניתן לדמיין על ידי PALM לרכוש פרמטרים נוספים של התבגרות cardiomyocyte.