ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

זיהוי אינטראקציות חלבון מולקולות קטנות חיוני למחקר ופיתוח של תרופות, כמו גם לטיפוח הבנתנו את המנגנונים הפתולוגיים העומדים בבסיס DTCs של הנגיף. שיטה זו מאפשרת ביו-פאנינג בתפוקה גבוהה של פפטידים לזיהוי תרופות ואימות גלובלי של אתרי קשירת תרופות על חלבונים עבור תרופות מולקולות קטנות מעניינות. כדי להכין שבב חיישן QCM, חבר שבב חיישן קרמי למתנד של מכשיר QCM של 27 מגה-הרץ ורשום את התדר הפנימי בשלב האוויר לפני קיבוע מולקולות קטנות.

לאחר ההקלטה, נתק את השבב והוסף בזהירות טיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסה נגזרת של מולקולה קטנה של מילי-מולרית אחת באתנול של 70% כדי ליצור שכבת מונו בהרכבה עצמית על אלקטרודת הזהב של שבב החיישן. מניחים את הצ'יפס בצלחת פטרי מרופדת ברקמה לחה, מגנים עליו מפני אור למשך שעה בטמפרטורת החדר לפני ששוטפים בעדינות את משטח האלקטרודה במים טהורים במיוחד. יבש את השבב במריחה עדינה של אוויר וטען את השבב על מנגנון ה-QCM.

לאחר שעה רשום את הירידה בתדירות בשלב האוויר כדי למדוד את כמות המולקולה הקטנה שהשתתקה. עבור ספריית פאג'ים T7 Biopanning, הנח קובטה עם מערבל מגנטי ייעודי על החיישן הביולוגי QCM המוגדר ל-1000 סיבובים לדקה והוסף שמונה מיליליטר של מאגר תגובה לקובט בזמן ערבוב המאגר חבר את שבב חיישן ה-QCM למתנד החזק את זרוע המתנד לחוץ כדי לטבול את השבב במאגר ולהתחיל לנטר את תדר ה-QCM. כאשר גרם החיישן מתאזן לסביבות שלושה הרץ לדקה של סחיפת תדרים, הזרקו שמונה מיקרוליטר של ספריית פאג'ים T7 לתוך הקובט וסמנו את נקודת ההזרקה על החיישן.

עקוב אחר הפחתת התדר הנגרמת על ידי פאג'ים T7 הנקשרים למולקולה הקטנה המשותקת על פני אלקטרודת הזהב. לאחר 10 דקות, עצור את צג התדרים QCM והרם במהירות את המתנד כדי להסיר את שבב החיישן מהאצווה, נתק את שבב החיישן מהמתנד והסר את המאגר מהשבב. הנח את שבב החיישן המיובש בצלחת פטרי לחה והוסף טיפה של 20 מיקרוליטר של תאי מארח E-coli בשלב לוג על אלקטרודת הזהב.

דגרו את המנה על מערבל מיקרופלייט של 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-1000 עד 1500 סיבובים לדקה למשך 30 דקות, מוגן מפני אור כדי לשפר את ההתאוששות של שבעת הפאג'ים הקשורים T7. בתום הדגירה העבירו את 20 המיקרוליטרים של תרחיף E-coli ל-200 מיקרוליטר של מדיום LB. על פי הנוהל הכללי, בצע את בידוד פלאק הפאג'ים בתווך וריצוף DNA המקודד את התרופה, מזהה רצפי פפטידים המוצגים על כל קפסיד פאג'.

לאחר תחזוקה של שבב החיישן, השתמש בתמיסת נתרן דודציל סולפט ספוגית צמר גפן כדי לנקות את משטח האלקטרודה, שטפו את משטח הזהב במים טהורים במיוחד וייבשו את האלקטרודה באוויר. לאחר מכן טפלו במשטח האלקטרודה בחמישה מיקרוליטרים של תמיסת פרנה טרייה שהוכנה למשך חמש דקות ולאחר מכן שטיפה במים טהורים במיוחד וייבוש באוויר פעמיים. כדי לבצע ניתוח ביואינפורמטי באמצעות RELIC פתח את תוכנית RELIC העצמאית במחשב עם מערכת הפעלה Windows והשתמש ברצפי חומצות האמינו של תרופות שנבחרו 15 פפטידים או חלבונים בודדים או מרובים בכל קובץ טקסט בפורמט A מהיר.

מקם את קבצי הטקסט הנדרשים בתיקייה של AA-div, מידע, מוטיב, התאמה, יישור הטרו, A con מהיר או סריקת A מהירה. לחץ על כל קובץ הפעלה בתיקייה העצמאית כדי לפתוח את הגרסה האישית של FTN 95 ולהזין את שם הקובץ והסיומת המתאימים בשורת הפקודה כדי להפעיל כל תוכנית ולקבל את קובץ פורמט הטקסט המתקבל. קבצי פורמט הטקסט המתקבלים מוצגים כאן.

לאחר מכן ייצא את קובץ הטקסט המתקבל לגיליון אלקטרוני כדי ליצור תרשים של תוכן מידע או ציוני דמיון מצטברים המחושבים באמצעות מכה כ-62. באמצעות אסטרטגיה זו, זוהו בהצלחה אתרי קשירה בודדים ומרובים של מולקולות קטנות על חלבוני המטרה עבור שש תרופות מולקולות קטנות. לדוגמה, 29 פפטידים המזהים את התרופה המאושרת קלינית Irinotecan משותקת כחד-שכבתית בהרכבה עצמית זוהו על ידי חיישן ביולוגי QCM המבוסס על ביו-פאנינג מחזור אחד יישור זוגי לאחר מכן של 29 הפפטידים ואצטילכולין אסטראז הניב ציונים מקסימליים עבור שאריות חומצות אמינו ספציפיות שהיו עקביות עם אלה המרכיבות את אתר הקישור של אירינוטקאן.

אותה תת-קבוצה של פפטידים זוהתה בהצלחה גם בקרבת השילוש הקטליטי בקרבוקסילאסטראז, מה שמצביע על כך שחומצות אמינו אלו יוצרות פיגום לזיהוי אירינוטקאן במהלך דה-אסטריפיקציה. 27 הפפטידים המזהים את התרופה נגד שפעת אוסלטמיביר המכסה את פני השטח של אלקטרודת הזהב של שבב חיישן QCM זיהו בהצלחה את אתר הקישור של אוסלטמיביר בנוראמינידאז. אתר קשירה זה מורכב מלולאות פפטיד לא מובנות שעלולות לעבור תנועה דינמית תוך כדי עגינה עם אוסלטמיביר.

תרופות, אזורים, כימיקלים, בקטריופאג'ים רקומביננטיים וחיידקים הם שמיעה ביולוגית ויש לטפל בהם בהתאם לפרוטוקול רווח התרבית. זכור תמיד ללבוש כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה ליתר ביטחון. בעקבות הליך זה, ניתן לאמת באופן גלובלי חלבוני מטרה לתרופות שונות בבני אדם, וירוסים פתולוגיים ואפילו צמחים כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ואת היעילות הטיפולית הפוטנציאלית של תרופות מעניינות.