המשימה ההתנהגותית של בחירה תלת-תאית באמצעות דג זברה כמערכת מודל
14 באפריל 2021
אנו מציגים תא התנהגותי שנועד להעריך את הביצועים הקוגניטיביים. אנו מספקים נתונים המראים כי לאחר שנרכשו, דגי זברה זוכרים את המשימה 8 שבועות לאחר מכן. אנו גם מראים כי דגי זברה היפרגליקמיים שינו את הביצועים הקוגניטיביים, מה שמצביע על כך שפרדיגמה זו חלה על מחקרים המעריכים קוגניציה וזיכרון.
אנו מראים כי ניתן להתאים משימת בחירה תלת-תאית שפותחה עבור מכרסמים כדי להעריך את הרכישה וההיפוך של לימוד האפליה החזותית בדגי הזברה. התא ההתנהגותי שלנו נועד להעריך את הביצועים הקוגניטיביים. לאחר הרכישה, דגי זברה זוכרים את המשימה שמונה שבועות לאחר מכן, מה שהופך אותה למתאימה למחקרים עם מוטציות של דגי זברה ו/או בעקבות חשיפה לסמים.
תוכיח את ההליך תהיה ד"ר קאסי רואו, דוקטורנט רשמית ממעבדת קונטון. כדי להכין תא בדיקה של שלושה תאים, תקן ערוץ בצורת U מאלומיניום לקירות הזכוכית הפנימיים של אקווריום 40 ליטר 50 על 30 על 30 ס"מ מעוקב כדי להפריד את האקווריום לשלושה תאים עם התא המרכזי בגודל 10 על 30 על 30 סנטימטרים מרכזיים מעוקבים. לאחר מכן להתאים 10 ס"מ מחיצות אטומות גבוה שנבנו מתוך יריעות PVC אפורות לשני הצדדים של ערוצי האלומיניום.
עבור כל משימת אפליה, השתמש בקלטת וו ולולאה כדי למקם חתיכות לבד בז', שחור או לבן על הגב, הצד והתחתון החיצוניים של תאי הבחירה. כפרס, מקם ארבעה דגי זברה בוגרים שאחרת לא ישמשו במחקר במיכל קטן וברור בפינה האחורית הרחוקה של כל תא בחירה כדי ליצור קבוצה של קונספירים. עבור התאקלמות קבוצתית עבור כל אחד משלושת הימים, חברו את רקע ה בז' לחלק החיצוני של שני תאי הבחירה והטביעו מיכל להקה חי בכל אחד מהתאים, ולאחר מכן הוסיפו חמישה עד שישה דגי זברה לתא ההתחלה המרכזי כששתי דלתות ההזזה פתוחות ואפשרו לדגים לשוטט בחופשיות במשך 30 דקות.
דג הזברה הניסיוני צריך להיות מסוגל לקיים אינטראקציה ולרועע עם דגי הלהקה דרך המיכל כפרס לאחר שחצה לתא בחירה במהלך השבחים. דג נחשב כמי שנכנס לאחד התאים הצדדיים כאשר כל גופו נכנס לתא. להסתגלות אישית, לאחר הקמת התא באותו אופן, הניחו דג זברה בודד בתא ההתחלה המרכזי עם דלתות הזזה סגורות.
לאחר שתי דקות, פתחו את שתי הדלתות בו זמנית וודאו שהראשון שוחה מהתא המרכזי דרך כל דלת בסך הכל 10 פעמים ב -30 דקות. לתגמל את הדג בכל פעם שהוא נכנס לאחד החדרים הצדדיים. לאחר השלמת ההסתגלות, הניחו חתיכת לבד לבן מחוץ לתא בחירה אחד וחתיכת לבד שחורה לחלק החיצוני של תא הבחירה האחר והניחו תגמול להקה רק באחד מתאי הבחירה.
זה הופך להיות הצד המתוגמל. כדי להתחיל ברכישה, הניחו דג ניסיוני אחד בתא ההתחלה עם תאי הבחירה סגורים. לאחר התאקלות של שתי דקות, פתחו בו זמנית את שתי הדלתות והתחלו שעון עצר כדי להעריך את השהיית הבחירה.
כדי לציין את תגובת הבחירה, כאשר הדג עושה בחירה על ידי הזנת אחד התאים הצדדיים, לעצור את הטיימר. אם הדג בוחר נכון את הצד המועדף, סגור מיד את הדלת בין התא המרכזי בצד זה כדי להגביל את הדג לצד המועדף למשך דקה אחת כדי לאפשר לראשון להיות מתוגמל על ידי אינטראקציה עם מיכל הלהקה. ציון משפט זה כ- C עבור נכון.
אם הדג שוחה דרך הדלת השגויה, השתמש ברשת כדי להעביר בעדינות את הדג בחזרה לתא המרכזי, לסגור את שתי הדלתות ולהבקיע את המשפט כפי שאני לא נכון. אם הדג לא מקבל החלטה תוך שתי דקות מפתיחת הדלתות, הזז את הדג לצד הנכון למשך דקה אחת והבקיע את המשפט כ- M עבור מסומן. לאחר שהדגים הוחזרו לתא המרכזי, המתינו דקה לפני ביצוע המשימה שוב.
לאחר שכל דג השלים שמונה ניסויי רכישה, סיווגו דגים שבחרו בהצלחה את הצד הנכון של המיכל לפחות פי שישה מתוך שמונה ביצועים גבוהים ואת הדגים שאינם עומדים בקריטריון זה כביצועים נמוכים. לאחר שזוהו, שוכנו הדגים בעלי הביצועים הגבוהים והנמוכה בנפרד. כאשר הדגים הוכיחו את היכולת לפתור משימת אפליה פשוטה, חברו את השחור-לבן לאותם צדדים של תאי הבחירה באשר למשימת הרכישה והטביעו את מיכל הלהקה בפינה האחורית הרחוקה של הצד שממול לזה של תא הבחירה שתוגמל בעבר.
בדוק את הדגים בנפרד כפי שהוכח. כאשר הצד המתוגמל מתהפך בהשוואה למשימת הרכישה, משימת ההיפוך מעריכה אם הדג יכול ללמוד היכן נמצא הפרס ללא קשר לצבע הרקע. כאשר הושלמו בסך הכל שמונה ניסויים במשך שלושת ימי הטיפול הרצופים, דווחו על תוצאות הניסויים כממוצעים קבוצתיים עבור כל בלוק של שני ניסויים בכל אחד משלושה ימי היפוך, תוך שמירה על הנתונים לדגים בעלי ביצועים גבוהים וביצועים נמוכים בנפרד כדי לקבוע אם שתי הקבוצות מציגות את אותה רמת ביצועים במהלך היפוך כפי שעשו במהלך הרכישה.
לאחר שלושה ימים של אימונים, בעלי חיים ניסיוניים המותנים באמצעות תגמול מבוסס להקה לוקחים בממוצע 125 שניות כדי להגיע להחלטה הראשונה שלהם וממוצע של 725 שניות כדי להשלים את משימת ההתאקלמות האישית כולה. לא נצפתה העדפת צד משמעותית במהלך ההתאקלמות ומספר הדגים המוחרגים הוא מינימלי בהשוואה לסוגי תגמול אחרים שנבדקו בעבר. במהלך שלב הרכישה, מספר בעלי החיים בעלי הביצועים הגבוהים גדל מדי יום עם דגים בעלי ביצועים גבוהים יותר שנצפו ביום השלישי לעומת היום הראשון.
השהיית הבחירה הראשונית עבור כל הדגים פוחתת בשלושת ימי הרכישה ומעידה על ביצועים משופרים עם כל יום רכישה. אותה מגמה נצפתה כאשר רק קבוצת הדגים בעלת הביצועים הגבוהים נחשבת. כפי שניתן לראות בניתוח יחס אפליה זה, כל הדגים מבצעים מעל במקרה עד סוף הרכישה, מה שמצביע על כך שהדגים למדו את משימת האפליה.
בעקבות רכישת למידה אפליה, הדגים מפגינים התנהגות הפוכה חזקה ואפליה מוגברת לאורך תקופת הלמידה בת שלושת הימים. פרדיגמת הבחירה בת שלושת התאים יכולה להיות מיושמת גם לבדיקת סיבוכים במחלה. לדוגמה, בניתוח זה, הסתגלות ורכישה של דגי זברה היפרגליקמיים הוערכו.
משימה זו מספקת בדיקה חזקה שניתן ליישם במחקרים שונים הבוחנים מחלות הקשורות התנהגותית כגון סיבוכים היפרגליקמיים של סוכרת, אלצהיימר ודמנציה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג תא התנהגות שתוכנן להערכת ביצועים קוגניטיביים בדגי זהב (zebrafish). התוצאות מעידות כי דגי זהב מסוגלים לזכור משימות למשך עד שמונה שבועות, וכי היפרגליקמיה משפיעה על יכולותיהם הקוגניטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פסיכולוגיה התנהגותית
- קוגניציה השוואתית
רקע
- למידה של הבחנה חזותית היא חיונית להבנת תהליכים קוגניטיביים.
- דגי זברה משמשים יותר ויותר כאורגניזם מודל במחקרי קוגניציה.
- מחקרים קודמים הראו כי דגי זברה מסוגלים ללמוד ולזכור משימות.
- היפרגליקמיה נקשרה לליקויים קוגניטיביים במינים שונים.
מטרת המחקר
- להתאים מטלת בחירה בת שלושה תאים עבור דגי זברה.
- להעריך את שימור הזיכרון לטווח ארוך בדגי זברה.
- לחקור את השפעות ההיפרגליקמיה על הביצועים הקוגניטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח של תא בדיקה לבחירה בעל שלושה תאים.
- הערכה של רכישת למידה של הבחנה חזותית והיפוכה.
- בדיקת שימור זיכרון לאורך זמן במשך שמונה שבועות.
- השוואה של ביצועים קוגניטיביים בדגי zebrafish נורמליים ובכאלה עם היפרגליקמיה.
תוצאים עיקריים
- דגי זברה למדו וזכרו את המשימה בהצלחה במשך שמונה שבועות.
- דגי זברה עם היפרגליקמיה הראו ביצועים קוגניטיביים משתנים.
- תא ההתנהגות מודד ביעילות יכולות קוגניטיביות.
- פרדיגמה זו מתאימה למחקרים נוספים על קוגניציה וזיכרון.
מסקנות
- משימת בחירה בעלת שלושה תאים היא שיטה יעילה לחקר קוגניציה בדגי זברה.
- ניתן להעריך שימור של זיכרון לטווח ארוך במודלים של דגי זברה.
- היפרגליקמיה משפיעה לרעה על הביצועים הקוגניטיביים, דבר המצדיק חקירה נוספת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקה התנהגותית זו מאפשרת הערכה אורכית של תפקוד קוגניטיבי בדגי zebrafish, ובכך תומכת בתיקוף מטרות עבור מודלים של מחלות ניוורו-דגנרטיביות ומטבוליות. היכולת לשמר זיכרון למשך שמונה שבועות מאפשרת מחקרי מינון כרוניים וסריקה גנטית במסלולי גילוי. תוצאים כמותיים של זמני תגובה (latency) ויחס הבחנה מספקים נקודות קצה ניתנות להעברה להפחתת סיכונים פרה-קלינית של תרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות הקושרות היפרגליקמיה לירידה קוגניטיבית באמצעות נקודות קצה התנהגותיות מדידות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות כימות של גרעונות בלמידה הפוכה במודלים של מחלה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי תרופות על ידי זיהוי תרכובות המשפרות את ביצועי יחס ההבחנה בדגי zebrafish עם היפרגליקמיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה בתוספת גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות הפעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS), תוך שימוש במוטיבציית תגמול מבוססת להקה.
- תוצרים כמותיים: הפקת מדידות של השהיית בחירה ויחס הבחנה, המאפשרות ניתוח תגובה למנה ואישור פגיעות (hit confirmation).
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לאורך שלבי הגילוי הודות לתכנון תאים סטנדרטי ופרמטרי תגמול להקה עקביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ליקוי קוגניטיבי הקשור להיפרגליקמיה, בהתאמה למחקרים על סיבוכים של סוכרת בתהליכי גילוי תרופות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני באמצעות הערכת גמישות קוגניטיבית לאורך שלבי הרכישה וההיפוך (reversal).
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע עבור קריטריונים להמשך קידום על ידי מדידת יציבות הביצועים בקבוצות דגים בעלות ביצועים גבוהים לעומת נמוכים במהלך למידת היפוך.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה גילויית על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות בנוגע לתקשורת בין המטבוליזם למערכת העצבים המרכזית (CNS), עם יישום ישיר במסעות לזיהוי מולקולות מובילות (leads) המכוונות לנקודות קצה קוגניטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי קישור מצב גליקמי ללמידה של הבחנה חזותית באמצעות בדיקות מבוססות תגמול מבוקרות.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור (זמן תגובה לבחירה, ניסיונות נכונים/שגויים/מסומנים) לצורך סריקת ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: מספק ניתוח של יחס הבחנה וממוצע קבוצתי על פני בלוקים של שני ניסיונות כדי לאפשר השוואה סטטיסטית של השפעות הטיפול.
- מחקר תרגומי: מתחבר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול השפעות של היפרגליקמיה כרונית לאורך חלונות שימור של שמונה שבועות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר להערכת גמישות קוגניטיבית במגוון מודלים של מחלות ומחלקות של תרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בחקירת נתיבים מטבוליים-CNS באמצעות פנוטיפ תנהגותי מדיד.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות גיאומטריה קבועה של התא, עקביות בתגמול הלהקה וקריטריוני ניקוד עיוורים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי אפקטים של הצלה קוגניטיבית המנבאים פוטנציאל תרגומי קליני.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות המראות שיפור בלמידה הפוכה (reversal learning) במודלים של היפרגליקמיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפנוטיפ התנהגותי של דגי זברה ובדירוג מבוסס וידאו של אירועי כניסה לתא.
- תלוי במכשור לתזמון מדויק של פעולות הדלת ומדידת השהייה באמצעות שעון עצר.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לתחזוקת מיכלי להקה ופרוטוקולי תגמול של בני אותו מין.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים בין זנים שונים של דגי זברה או רקעים גנטיים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שונות באקלמציה אינדיבידואלית וקריטריוני החרגה המבוססים על ספי סף להחלטה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Three-Chamber Choice Testing Chamber Preparation and Discrimination Setup
1:39
Behavioral Tasks
2:49
Acquisition Task
3:25
Denoting the Choice Response
4:48
Experimental Treatment
5:47
Results: Representative Three-Chamber Choice Zebrafish Behavioral Task Analyses
7:21
Conclusion
