ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes
9 בנובמבר 2020
כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.
שיטת קיבוע השיפוע, בה מבוצעת צנטריפוגה של שיפוע גליצרול בנוכחות מקשר צולב, מסייעת בזיהוי אינטראקציות בין חלבונים הנקשרים באופן חולף לקומפלקסים מרובי תת-יחידות. השימוש בריאגנטים לקיבוע בשיפוע הגליצרול מייצב את קשירת הגורמים הרופפים, ללא היווצרות משקעים, ומאפשר זיהוי האינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם קומפלקסים למחצה מחוברים. ההדגמה של פרוטוקול הקצה עוזרת למשתמשים בפעם הראשונה ללמוד מידע שעשוי להיות קשה להבנה מטקסט כתוב בלבד.
להכנת תמצית כוללת של שמרים, גדל את תאי השמרים המבטאים את אחד מגורמי השחבור המאוחים לתג הברז וליטר אחד של מדיום גלוקוז Y ו-B בתוספת חומצות אמינו או בסיסי גרעין מתאימים. כאשר התרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של אחד, אוספים את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגות של 500 מיליליטר, ושוטפים את התאים פעמיים ב-10 מיליליטר מים סטריליים קרים לכל שטיפה. לאחר השטיפה השנייה, השעו מחדש את התאים בעשירית מנפח התא של מאגר קר A, והקפיאו 50 טיפות מיקרוליטר מתרחיף תאי השמרים בחנקן נוזלי.
לאחר ההקפאה, טוחנים את כדורי התאים הקפואים בשישה מחזורים ב-20 הרץ למשך שלוש דקות במכשיר טחנת כדורים, וטובלים את מיכל התאים הקפואים בחנקן נוזלי בסוף כל מחזור. לאחר המחזור האחרון, הכניסו את הצינורות המכילים את התמציות למים בטמפרטורת החדר עם ניעור מדי פעם. לאחר ההמסה, צנטריפוגה לאיסוף התמציות.
ולכמת את החלבון שהסופרנטנטים נוקו בשיטת BCA. לאחר מכן הקפיאו במהירות את כמות התמציות בחנקן נוזלי לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס. להכנת שיפוע גליצרול, הוסף ריכוז סופי של 0.1% של החומר הצולב גלוטרלדהיד לתמיסת 30% גליצרול וחוצץ A, וערבב להומוגניזציה.
הוסף שישה מיליליטר של גליצרול קר 10% וחוצץ תמיסת A לצינור צנטריפוגה של 12 מיליליטר והשתמש במזרק מכשיר ראשי שיפוע המצויד במחט ארוכה כדי לשכב את תמיסת הגליצרול גלוטראלדהיד 30% בתחתית הצינור. השתמש בהתקן ראשי של שיפוע כדי ליצור שיפוע גליצרול ליניארי בהתאם למפרט היצרן. שכבה זהירה של 200 מיקרוליטר של גליצרול 7% וחצץ כרית A לחלק העליון של השיפוע לפני הוספת כשני מיליגרם תמצית תאים לחלק העליון של הצינור.
לאחר יצירת שיפוע גליצרול, הנח את הדגימה ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש ואסוף את התמצית על ידי צנטריפוגה. בחר את הדגימה מכל צינור דגימה של 12 מיליליטר ב-24,500 שברים של מיקרוליטר, והשתמש במשאבה פריסטלטית כדי לדחוף תמיסת גליצרול של 40% דרך השיפוע של 10 עד 30% מהצינור לאוסף השברים. לאחר מכן טען 50 מיקרוליטר מכל שבר ישירות על ממברנות הניטרוצלולוזה על כתם נקודה, ולאחר מכן הוסף חיץ חוסם, והשתמש בנוגדנים ראשוניים נגד CBP כדי לזהות את החלבון על הכתם החיסוני, ונוגדנים משניים מתאימים לפי הצורך.
בהיעדר קישור צולב CWC 24 מרוכז בין שברים 5 ו-13, המקבילים לקומפלקסים של כ-80 עד 200 מגה-דלטון. עם זאת, בנוכחות המקשר הצולב, המיקום של CWC 24 על השיפוע מועבר לשברים בתחתית השיפוע המתאימים לקומפלקסים גדולים יותר. השוואת שקיעת CWC 24 לזו של יחידת המשנה U5 snRNP, Prp8, ותת-יחידת NTC, Prp19 מגלה ש-CWC 24 מרוכז באותם שברים.
אבל, מכיוון שהוא מתקשר באופן חולף עם הספליסאוזום, הוא קיים גם בשברים הקלים יותר. מעניין ששברים 11 ו-12 הם אלה שבהם Prp8 ו-19 מתחילים להתרכז, מה שמרמז על כך שזהו החלק של השיפוע שבו קומפלקס B Act מתחיל לשקוע. ניתוח כתמים מערביים של שברים 11 ו-12 חושף אותות Prp8 ו-19 כמריחות שבקושי נכנסות לג'ל אקרילאמיד של 8%, מה שמראה שהם אכן חלק מקומפלקסים גדולים.
CWC 24 קיים גם בשבר 12, אך בריכוז נמוך בהרבה, התואם את הקישור החולף שלו לקומפלקס B Act. יחד, תוצאות אלה מראות כי גלוטרלדהיד יכול לשמש כמקשר צולב לייצוב הקישור של גורמים חולפים לתת-קומפלקסים שחבור. ניתן ליישם שיטה זו לחקר כל קומפלקסים של תת-יחידות מוטוריות דינמיות המקושרות באופן חולף לחלק ממרכיביהם, כגון ה-spliceosome.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את שיטת הקיבוע במדרג (gradient fixation), המשתמשת בסנטריפוגציה במדרג גליצרול עם חומר מקשר (cross-linker) כדי לזהות אינטראקציות חולפות בין גורמי שחזור (splicing factors) לבין קומפלקס הספלייסוזום (spliceosome complex). שיטה זו מייצבת אינטראקציות חלבוניות רופפות ללא היווצרות משקעים, ובכך מאפשרת את חקרן של אינטראקציות חלבוניות ספציפיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- קיבוע במדרג (Gradient fixation) הוא טכניקה המשמשת לחקר אינטראקציות בין חלבונים.
- היא מסייעת בזיהוי אינטראקציות חולפות בתוך קומפלקסים רב-תת-יחידות.
- השימוש במקשרי צלב (cross-linkers) משפר את היציבות של אינטראקציות אלה.
- שיטה זו שימושית במיוחד לחקר גורמי שחור (splicing factors).
מטרת המחקר
- להדגים את שיטת הקיבוע במדרג (gradient fixation) לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים.
- לספק פרוטוקול המסייע למשתמשים מתחילים להבין את הטכניקה.
- להקל על חקר גורמי שחבור (splicing factors) בשמרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה במדרג גליצרול עם חומר מקשר (cross-linker).
- הכנת תמריות כוללות משמרים המבטאים גורמי שחבור (splicing factors).
- איסוף ושטיפה של תאי שמרים.
- הקפאה של תרחיפי תאים לצורך ניתוח המשכי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מייצבת בהצלחה אינטראקציות חלבוניות חולפות.
- זוהו אינטראקציות ספציפיות בין גורמי שחבור (splicing factors) לבין הספלייסוזום (spliceosome).
- הפרוטוקול נגיש לחוקרים שאינם מנוסים בטכניקה.
- הדגמת הפרוטוקול הסופי מסייעת להבנה מעשית.
מסקנות
- קיבוע במדרג ריכוזים (Gradient fixation) הוא שיטה יעילה לחקר אינטראקציות חלקיות של חלבונים.
- טכניקה זו יכולה לשפר את הבנתנו לגבי מנגנוני שחבור (Splicing).
- היא מספקת כלי בעל ערך לחוקרים בביולוגיה מולקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
זיהוי אינטראקציות חלבוניות חולפות הוא קריטי לתיקוף מטרות בקומפלקסים דינמיים כגון הספלייסוזום (spliceosome), שבהם קשרים חלשים או קצרי-מועד עלולים להתפספס בשיטות קונבנציונליות. שיטת ה-Grafix (Gradient Fixation) מייצבת אינטראקציות אלו באמצעות צנטריפוגציה במדרג גליצרין עם חומר מקשר (cross-linker), מה שמאפשר זיהוי ללא היווצרות משקעים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת שותפי קישור במערכות רלוונטיות למחלות, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אינטראקציות חולפות של גורמי שחבור (splicing factors) שעשויות להוות מטרות טיפוליות במסלולי עיבוד RNA.
- ערך תפעולי: מייצב קושרים חלשים לצורך זיהוי, ובכך מפחית תוצאות שגויות שליליות במערכים לתיקוף מטרות.
- ערך מדעי: תומך בהבהרת מסלולים על ידי מיפוי של שקיעה משותפת (co-sedimentation) של גורמים כגון CWC 24 עם U5 snRNP ותתי-יחידות של NTC.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת קומפלקסים מופרדים (fractionated) לאנליזה המשכית באמצעות dot blot, המאפשרת הערכה כמותית של נוכחות גורמי שחור (splicing factors).
- ערך תפעולי: יצירת פרופילי שקיעה הניתנים לשחזור, שניתן להסדירה באופן אחיד בין הרצות שונות לצורך עקביות הבדיקה.
- ערך מדעי: סיוע במוכנות לסריקה על ידי בידוד תתי-קומפלקסים בתוך מקטעי גרדיאנט מוגדרים לצורך בדיקה ממוקדת.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות רלוונטיות למחלות לגבי דינמיקה של הספליסוזום (spliceosome), המעורבים בסרטנים ובהפרעות נוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי ייצוב של אינטראקציות חולפות לצורך מעקב פונקציונלי.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין קשרים יציבים לקשרים חולפים במכונות מקרו-מולקולריות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת ה-Grafix משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בבדיקת היפותזות של אינטראקציות חולפות לפני המעבר לזיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחן השערות לגבי קישור רגעי של גורמי שחבור (splicing) באמצעות ייצוב אינטראקציות לצורך זיהוי בפרקציות של מדרג (gradient).
- סריקה: מייצר פרקציות מוכנות לבדיקה באמצעות מדרגי גליצרין סטנדרטיים, המאפשרים סריקה שחזירה של תרכובות או גורמים.
- אנליטיקה: מספק נתוני שקיעה כמותיים ותוצרי קו-לוקליזציה (למשל, CWC 24 עם Prp8/Prp19) להשוואת תנאים ולהערכת שינויים בקישור.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי זיהוי גורמים שהקישור הרגעי שלהם עשוי להיות מושפע במצבי מחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לחקר כל קומפלקס של תתי-יחידות דינמיות עם רכיבים רגעיים, ללא הגבלה לספלייסוזום.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי חשיפת אינטראקטורים חולפים שאובדים בדרך כלל בליזטים סטנדרטיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות יצירת גרדיאנט ופרקציונציה סטנדרטיים, ובכך מפחית את השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) על ידי הבהרת עמימות מכניסטית בקומפלקסים של מטרות רב-תתי-יחידות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על רשתות אינטראקציה מאוששות במערכות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליזיס של תאי שמרים, הכנת גרדיאנטים וטכניקות פרקציונציה.
- תלוי בגישה למכשירי הכנת גרדיאנטים, רוטורי swing bucket וציוד פרקציונציה.
- מצריך סטנדרטיזציה של ריכוז החומר המקשר (למשל, glutaraldehyde) כדי למנוע ייצוב יתר או שקיעה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על מערכות שאינן שמרים או על קומפלקסים חלופיים.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון מיסוך פוטנציאלי של אפיתופים כתוצאה מהקישור הצולב, דבר המצריך תיקוף של נגישות הנוגדנים לאחר הקיבוע.
