יישום מערכת RatWalker לניתוח הליכה במודל חולדה גנטי של מחלת פרקינסון
18 בינואר 2021
כאן אנו מתארים את מערכת RatWalker, שנבנתה על ידי תכנון מחדש של מנגנון MouseWalker כדי להתאים לגודל ולמשקל המוגדלים של חולדות. מערכת זו משתמשת בהשתקפות פנימית כוללת מתוסכלת (FTIR), לכידת וידאו במהירות גבוהה ותוכנת ניתוח בגישה פתוחה כדי לעקוב אחר פרמטרים של הליכה ולכמת אותם.
שיטה זו מאפשרת לכמת באופן משוחזר הבדלים בפרמטרים של הליכה. ניתן להעריך את פרמטרי ההליכה במכרסמים ההולכים בחופשיות, והטכניקה אינה מסתמכת על צעדים פולשניים כגון טבילת כפות הרגליים בדיו. מי שידגים את ההליך יהיה בן למברטי.
התחילו על ידי הצבת כלוב ביתי בסוף השביל לפני תחילת כל ריצה, כדי לשמש רמז חיובי עבור החולדה לחצות את השביל. כבו את אורות החדר. הפעל את המצלמה והתחל להקליט מספר שניות לפני שהחולדה מונחת על הרציף.
עם התקנת המארז, הניחו את החולדה בקצה השביל, מול הכלוב הביתי, ואפשרו לה לחצות את השביל בצורה לא מאולצת. הפסק להקליט ברגע שהחיה מגיעה לקצה השביל. נקו את השביל באמצעות 70% אתנול ומגבת לא שוחקת בין ריצות ולאחר שבעל חיים משתין או עושה את צרכיו.
לאחר מכן, לאפשר אתנול להתאדות לפני הצגת חיה אחרת. הריצו את החולדות לאורך השביל בסך הכל שבע פעמים במהלך כל תקופת תצפית, ולקחו את שלוש הריצות הראשונות שקיבלו ציון עובר לניתוח. ציון ריצה כעובר אם בעל החיים עושה ארבעה צעדים רצופים או יותר לכיוון הכלוב הביתי ללא הפרעה עקב טיפוח, השתהות או תנועות שגויות.
ניתוח הליכה בוצע על חולדות פרא ופרקין DKO זכרים בגיל חודשיים כדי לקבוע אם השימוש בניתוח הליכה קינמטי יכול לחשוף ליקויים מוטוריים עדינים לפני הופעת בעיות מוטוריות גסות. למרות המשקל המוגבר של חולדות DKO, לחץ כף הרגל שהופעל על משטח ההליכה לא השתנה. לאחר הערכה של מספר פרמטרים של הליכה כפונקציה של מהירות הליכה, נמצא כי מהירות ההליכה ואורכי הצעדים דומים בין חולדות מסוג בר וחולדות DKO.
השונות בין חולדות מסוג בר לחולדות DKO באה לידי ביטוי בשלב העמידה ובמשך הנדנדה במהירויות הליכה איטיות יותר. החלק של מחזור הצעד שבו הרגל נמצאת בשלב העמידה היה גורם החובה. יותר זמן בילה בשלב הנדנדה מאשר בשלב העמידה ככל שגורם החובה ירד.
יתר על כן, בעוד שמהירויות הנדנדה גדלו עם העלייה במהירות בחיות בר, המתאם היה קהה בחולדות DKO. ניתוח ההליכה של FTIR שימש גם ליצירת חלקות של עקבות שלב העמידה של כל רגל ביחס לגוף בחולדות ההולכות בחופשיות. לאחר השוואת מיקום הכפות, נצפו שינויים משמעותיים ב- AEP וב- PEP.
מספר פרמטרים נוספים השתנו באופן משמעותי בחולדות DKO בהשוואה לסוג הבר. מהירות הנדנדה של הגפיים האחוריות השמאלית והימנית הוגדלה בחולדות DKO, בעוד שמשך הנדנדה של הגפיים האחוריות השמאלית והימנית הופחת. התקנה עקבית של ציוד, כולל מיקום המצלמה ביחס ל- RatWalker, חשובה ליישום מוצלח של פרוטוקול זה.
לאחר ביצוע פרוטוקול זה, בעלי חיים זמינים לכל התנהגות נוספת או נקודות קצה ניסיוניות הדרושות. לדוגמה, שינויים בהליכה יכולים להיות מתואמים עם שינויים היסטולוגיים. טכניקה זו יכולה לשמש להערכת הליכה במודלים אחרים של מכרסמים שאינם PD, כגון מודלים של חרדה ודיכאון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג את מערכת ה-RatWalker, שתוכננה לניתוח הליכה בחולדות ההולכות בחופשיות באמצעות החזרה פנימית מלאה מתוסכלת (FTIR) ולכידת וידאו במהירות גבוהה. מערכת זו מאפשרת כימות מדויק של פרמטרי הליכה, ומספקת תובנות לגבי ליקויים מוטוריים, ובמיוחד בחולדות Parkin DKO שעברו שינוי גנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- הערכת הליכה
רקע
- ניתוח הליכה במכרסמים מסתמך בדרך כלל על שיטות פולשניות.
- מחקרים קודמים הראו את הצורך בשיטות לא פולשניות משופרות להערכת תפקוד מוטורי.
- ה-RatWalker הוא התאמה של מערכת ה-MouseWalker עבור מכרסמים גדולים יותר.
- מערכת זו יכולה לסייע בזיהוי ליקויים מוטוריים עדינים לפני הופעת תסמינים גלויים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לא פולשנית לניתוח הליכה בחולדות.
- בחינת הבדלי הליכה בין חולדות מסוג wild-type לחולדות Parkin DKO.
- ביסוס פרוטוקול מהימן למעקב אחר פרמטרי הליכה לאורך מספר ניסויים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת RatWalker שימשה לניתוח ההליכה של חולדות שהלכו באופן חופשי.
- המודלים הביולוגיים היו חולדות זכרים מסוג wild-type וחולדות Parkin DKO בגיל חודשיים.
- במחקר לא הוזכרו תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- החולדות הלכו לאורך מסלול ההליכה שבע פעמים בסך הכל, כאשר הניקוד התבסס על צעדים עוקבים.
- פרמטרי הליכה כומתו באמצעות FTIR וניתוח וידאו.
תוצאות עיקריות
- ניתוח ההליכה חשף הבדלים משמעותיים בשלב המעמד (stance phase) ובמשך שלב התנופה (swing duration) של חולדות DKO במהירויות נמוכות יותר.
- למרות מהירויות הליכה דומות, חולדות DKO הראו פרמטרים זמניים משונים של ההליכה בהשוואה לחולדות מסוג בר (wild-type).
- נצפו שינויים חשובים במיקום כפות הרגליים ובמהירויות התנופה בחולדות DKO.
- המחקר מדגיש את חשיבות העקביות בציוד לקבלת תוצאות מהימנות.
מסקנות
- מערכת ה-RatWalker מאפשרת ניתוח הליכה לא פולשני עם פוטנציאל ליישומים רחבים יותר במגוון מודלים של מכרסמים.
- הממצאים תורמים להבנת הליקויים המוטוריים במודלים גנטיים של מחלות.
- ההשלכות של המחקר חלות על חקירת הפרעות בהליכה הקשורות למצבים נוירולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מוקדם של ליקויי מוטוריקה עדינים במודלים גנטיים תומך בתיקוף של מטרות טיפוליות ובצמצום סיכונים מנגנוניים בתוכניות למחלות ניווניות של מערכת העצבים. מערכת ה-RatWalker מאפשרת ניתוח הליכה כמותי ולא פולשני שיכול לזהות שינויים פנוטיפיים לפני הופעת גרעונות מוטוריים גסים, ובכך לשפר את הביטחון החזוי בסינון פרה-קליני. גישה זו מסייעת בתעדוף מועמדים טיפוליים על ידי אספקת ביומרקרים ניתנים לתרגום של ירידה תפקודית במודלים של מחלת פרקינסון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות פרמטרים של הליכה במודלים גנטיים של חולדות למחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה הדירה של תפקוד מוטורי במכרסמים ההולכים באופן חופשי.
- ערך ניבוי: מסייע באפיון פנוטיפי מוקדם לצורך קביעת רמת הביטחון במטרה וקבלת החלטות לגבי תיעדוף הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים ברזולוציה גבוהה של הליכה, כולל שלב המגע עם הקרקע (stance phase), משך שלב התנופה (swing duration) ומיקום כפות הרגליים לצורך ניתוח השוואתי.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות סטנדרטיות וניתנות להרחבה (scalable), המתאימות לפיתוח בדיקות (assays) ומסעות סריקה של תרכובות.
- שחזוריות: דורש הגדרה עקבית של הציוד וקריטריונים אחידים לדירוג כדי להבטיח נתונים מהימנים בין ניסויים ומעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין שינויים בהליכה לבין תוצאים היסטולוגיים כדי לגשר בין ממצאים התנהגותיים לנוירופתולוגיים.
- מערכת רלוונטית למחלה: ממדלת תפקוד מוטורי לקוי בשלב מוקדם של מחלת פרקינסון גנטית, לפני הופעת תסמינים גלויים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מזהה ביומרקרים מבוססי הליכה המשקפים נוירופתולוגיה בסיסית במודלים עם חסר ב-Parkin/Pink1.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מערכת ה-RatWalker משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה (target validation), דרך זיהוי מועמד מוביל (lead identification) ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך היא מאפשרת הערכה איטרטיבית של פנוטיפים מוטוריים לאורך שלבי המחקר.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות מדידת ליקויי הליכה במודלים גנטיים כדי לתקף מעורבות של מטרה ומודולציה של מסלולים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות מוכנות לבדיקה לצורך הערכת השפעות טיפוליות על התפקוד המוטורי במודלים של מכרסמים.
- אנליטיקה: מספקת פרמטרים קינמטיים כגון duty factor, מהירות נדנוד וסימטריית צעד להשוואה אובייקטיבית בין גנוטיפים.
- מחקר טרנסלציונלי: מאפשרת מתאם בין שינויים בהליכה לבין סממנים של ניוון עצבי כדי לתמוך בהתאמת ביומארקרים ובתובנות פתופיזיולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולא פולשנית, הישמה על מגוון מודלים של מחלות נוירולוגיות מעבר למחלת הפרקינסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי זיהוי ליקויים מוטוריים מוקדמים המשקפים תסמינים קליניים פרודרומליים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות מעבר סטנדרטי במסלול ההליכה, ספי סיווג ובקרות סביבתיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי הפחתת ההסתמכות על מדדים פנוטיפיים בשלבים מאוחרים בפיתוח פרה-קליני.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי זיהוי מודלים בעלי תוקף מבנה (construct validity) לסריקה טיפולית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירו-מדע התנהגותי ובניתוח תנועה מבוסס וידאו לצורך הגדרה ופרשנות נכונות.
- תלוי במיקום עקבי של המצלמה, בתנאי התאורה ובניקיון מסלול ההליכה כדי למזער שונות.
- מחייב הסכמה בין חברי הצוות לגבי קריטריונים לניקוד ריצות (למשל, ארבעה צעדים רצופים) כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- יש להתחשב בדפוסי התנועה הספציפיים למין בעת התאמת המערכת למודלים או זנים אחרים של מכרסמים.
- מוגבל להערכת פרמטרים זמניים ומרחביים של ההליכה; אינו לוכד רצפי תנועה מורכבים או קינמטיקה עדינה של הגפיים ללא שימוש בשיטות משלימות.
