ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים
16 במאי 2021
שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.
פרוטוקול ניקוי רקמות חדשני זה משפר את הטכנולוגיה הקיימת כדי לאפשר מבט מדויק יותר ב- vivo על סוגי תאים ספציפיים בלב והתנהגותם בתנאי פציעה. פרוטוקול זה הוא מהיר ופשוט למדי. זה מאפשר שמירה על פלואורסצנטיות מארקה עם הפרעה מינימלית מן פלואורסצנטיות אוטומטית רקמת רקע ללא צורך כתם תא או רקמות.
התחל באמצעות כרית גזה ספוגה באתנול של 70% כדי לנקות את פני השטח הגחוניים של העכבר הניסיוני. השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי של שלושה סנטימטרים, כשלושה מטרים מתחת לתהליך xiphoid ולשחרר את העכבר מהבטן לתהליך xiphoid כדי להפריד את העור מרקמת דופן הבטן הבסיסית. בצע חתך רוחבי של שני סנטימטרים ברקמת דופן הבטן התת עורית, שלושה סנטימטרים מתחת לתהליך xiphoid ולעשות חתך אנכי מן החתך הזה במעלה קו האמצע דרך כלוב הצלעות.
הצמד את כלוב הצלעות בחזרה כדי לחשוף את הלב. ולהשתמש מזרק 10 מיליליטר מצויד במחט 27 מד להזריק PBS קר לתוך קאווה vena מעולה ואבי העורקים. כאשר כל הדם כבר סמוק מהלב, לספק 10 מיליליטר של קר 4%PFA לתוך ורידים מעולה אבי העורקים כדי להתחיל את תהליך הקיבעון.
כאשר כל התיקון כבר הבזיק, בלו את הלב ולהשתמש אזמל להב ישר כדי להפריד את atria, החדר הימני מחיצה ואת החדר השמאלי. מניחים את הלב לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר של קר 4%PFA עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על מאגוז. למחרת בבוקר, הוסיפו פתרון יוזם 0.25% לתמיסת הידרוג'לים שהוכנה זה עתה והעבירו את הלב לג'ל ההידרו.
לעטוף את הצינור חרוט בנייר כסף עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס ללא הפרעה פיזית. למחרת בבוקר לחמם את הצינור באמבטיה חרוזים 37 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות לפני השימוש מלקחיים להעביר בזהירות את הלב לתוך צינור 15 מיליליטר של PBS. לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS במשך שעה אחת לכל לשטוף ב 37 מעלות צלזיוס על מאגוז ולהעביר את הלב לתוך הסל של מכונת אלקטרופורזה פעילה.
לאבטח את המכסה במקום ולמלא את מאגר תא אלקטרופורזה פעיל עם פתרון ניקוי אלקטרופורזה. ברגע שהתא מלא, להטביע את הסל בתמיסה ולהדק את המכסה על מכונת האלקטרופורזה למקומו. לאחר מכן הפעל את מכונת האלקטרופורזה ב 1.5 אמפר ו 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
לאחר אלקטרופורזה, בדוק את הראייה של הלב כדי לוודא שלא נותרה רקמה אטומה. לשטוף את הלב פינה שלוש פעמים ב 15 מיליליטר שתיים במשך שעה אחת PBS טרי ב 37 מעלות צלזיוס לכל לשטוף על מוצף. לפני שקוע את הלב סוכן decolorizing כדי להפחית פלואורסצנטיות אוטומטי heme.
לאחר 48 שעות, לשטוף את הלב שלוש פעמים PBS כפי שהוכח ולשקול את הלב RIMS מוכן טרי במשך 48 שעות לפני ההדמיה. להדמיה תלת-ממדית של הלב הנקה, תחילה, הניחו שכבה דקה של שומן ואקום על תחתית מאגר תחתון מודפס בתלת-ממד, באותו גובה שבו נראית הדגימה. מלא את המאגר ב- RIMS והשתמש בקצה פיפטה כדי להסיר בועות.
בזהירות למקם את הלב RIMS עם הקיר החדר השמאלי פונה כלפי מעלה, דואג כי אין בועות שהוכנסו לתוך הפתרון. השתמש גריז ואקום לצרף להחליק כיסוי זכוכית על פני השטח התחתון של פיסת המאגר העליון מודפס 3D ומניחים את מכסה המאגר העליון למטה על המאגרים התחתונים, דואג למנוע בועות. ואז למלא את המאגרים העליונים עם גליצרול.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לדמות את הלבבות המנוקוים. שילוב של ניקוי רקמת לב מעודנת עם הדמיה תלת-ממדית מאפשר הדמיה מפורטת ומתקדמת של פיברובלסטים לבביים. באמצעות טכניקת הדמיה זו, fibroblasts הם נצפו להיות צפוף ארוז יש מורפולוגיה צירים בלבבות לא נפגעים.
לאחר פציעת רפרופוזיה איסכמיה, אובדן של פיברובלסטים לב נראה באזור איסכמי במשך שלושת הימים הראשונים לאחר פציעה. ביום השביעי וה-14, הפיברובלסטים היגרו או התפשטו כדי לאכלס מחדש את אזור הרקמות הפצועות. ביום ה-28, אוכלוסיית הפיברובלסטים הלבביים המקיפים את האזורים הפצועים של הלב נמצאים בצפיפות הגבוהה ביותר שלהם.
יום וחצי לאחר פציעת אוטם שריר הלב, מעט פיברובלסטים נשארים בחדר השמאלי הפצוע. ביום השלישי, לעומת זאת, הפיברובלסטים מתרחבים ונוכחים ברוב החדר השמאלי. בניגוד לניתוח איסכמי, עירוי של אנגיוטנסין 2 ופנולפרין במשך מספר שבועות אינו גורם לאובדן רקמת לב ודילול קיר.
במקום זאת, פיברובלסט ליישר לאורך הציר של דפוס התכווצות סליל ימני כפי שניתן לראות בעת שימוש מעודן פרוטוקול ניקוי רקמות. בנוסף, לאחר טיפול אנגיוטנסין 2 ו phenolefrin, fibroblasts מופיעים קטנים מעוגלים בניגוד לצורת ציר שנצפו במודלים של תפוצת איסכמיה ופציעה אוטם שריר הלב. הסליקה האלקטרופורטית צריכה להתבצע בזהירות במיוחד כאשר עובדים עם לבבות שעברו פרוטוקולי פציעה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך כיצד פיברובלסטים לב מגיבים לפציעה ב vivo. סמני פלואורסצנט שונים יכולים לשמש גם כדי להבין כיצד הלב מגיב לפציעה ברמה התאית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פותחה שיטה משופרת להשקיפות רקמות (tissue clearing) עבור לב של עכבר בוגר, המאפשרת הדמיה של סוגי תאים ספציפיים תוך מזעור האוטו-פלוורסנציה של הרקע. פרוטוקול זה משפר טכניקות קיימות למחקר של רקמת לב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- הנדסת רקמות
רקע
- טכניקות להבהרה של רקמות (Tissue clearing) הן חיוניות עבור דימות של רקמות ביולוגיות דחוסות.
- פלוורסצנציה עצמית (Autofluorescence) עלולה להסוות אותות תאיים ספציפיים במחקרי דימות.
- שמירה על הפלוורסצנציה של תאים מסומנים היא קריטית לצורך ניתוח מדויק.
- שיטות קיימות עשויות לדרוש צביעה, דבר המסבך את התהליך.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהיר ופשוט להשקיפות רקמות.
- שיפור הוויזואליזציה של פלורסצנציית פיברובלסטים ברקמה לבבית.
- הפחתת הפרעות רקע הנובעות מאוטופלורסצנציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש ב-70% ethanol לניקוי פני השטח הוונטרליים של העכבר.
- בוצעו חתכים כירורגיים כדי להגיע ללב.
- הופעל פרוטוקול השקיפות החדש על רקמת הלב.
- שומר על פלואורסצנציית המותג ללא צביעה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול החדש ביצע שקיפות יעילה של רקמת לב דחופה.
- הפלואורסצנציה של הפיברובלסטים נשמרה במהלך התהליך.
- הפחתה משמעותית נרשמה באוטופלואורסצנציית הרקע.
- השיטה מאפשרת דימות in vivo טוב יותר של תאי לב.
מסקנות
- שיטה מזוקקת זו משפרת את חקר רקמת הלב.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחוקרים הבוחנים תגובות לפגיעה בלב.
- הפרוטוקול יעיל ומצמצם את הצורך בצביעות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הדינמיקה של פיברובלסטים של הלב בתלת-ממד מספקת תובנות קריטיות לגבי מנגנוני הפיברוזיס המניעים את הקשיחות של החדרים ואת התקדמות אי-ספיקת הלב. גישה מזוקקת זו להבהרת רקמה המבוססת על CLARITY מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של איבר שלם, המציגה את התנהגות הפיברובלסטים ללא מגבלות של חדירת נוגדנים או אובדן פלואורסצנציה, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מנגנונית בתהליכי תיקוף של מטרות קרדיו-וסקולריות. השיטה בעלת ערך ניבוי על ידי חשיפת תגובות של פיברובלסטים ברזולוציה מרחבית למודלים של פגיעה איסכמית ולא-איסכמית, ובכך היא מסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מיקום ומורפולוגיה של פיברובלסטים ברקמה שלמה כדי להבהיר תפקידים פתוגניים לעומת תפקידים רפואיים בפיברוזיס של הלב.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור סימון גנטי של פיברובלסטים (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) לפנוטיפים מרחביים בלבבות בריאים ופגועים.
- ביטחון חיזוי: חושף דפוסים של פיברובלסטים הספציפיים לפגיעה — כגון רצועות מיושרות לאחר מתן angiotensin II/phenylephrine או התאכלוס מחדש מאזורי הגבול לאחר איסכמיה — כדי להפחית סיכונים בהשערות מכניסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר לבבות שקופים המסומנים פלואורסצנטית, התואמים לדימוי קונפוקאלי לצורך ניתוח תלת-ממדי כמותי של צפיפות פיברובלסטים, התפלגותם ומורפולוגייתם.
- הסמיכות (Reproducibility): הבהרה סטנדרטית מבוססת אלקטרופורזה (1.5 amps, 37°C, 1.5 hours) ואיזון RIMS מבטיחים תכונות אופטיות עקביות של הרקמה בין הקבוצות הניסיוניות.
- מדרגיות (Scalability): תואם לעיבוד של מספר דגימות בתאי אלקטרופורזה פעילים, מה שמאפשר השוואה מקבילה בין מודלים של ביקורת, איסכמיה ופגיעה כתוצאה מיתר לחץ דם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מערכת רלוונטית למחלה: לוכדת תגובות של פיברובלסטים במודלים המדמים פגיעה איסכמית אנושית (reperfusion) ועומס לחץ (angiotensin II/phenylephrine), בהלימה עם פנוטיפים קליניים של פיברוזיס.
- המשכיות תרגומית: עוקבת אחר מוות של פיברובלסטים, התח fullest של אזור הגבול ושיאי צפיפות ביום ה-28 לאחר האיסכמיה — חלונות זמן מרכזיים לבחינת התערבויות אנטי-פיברוטיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבדילה בין פיברובלסטים פרו-פיברוטיים בעלי צורה של צמיג (spindle-shaped) באיסכמיה לבין פנוטיפים קטנים ועגולים ביתר לחץ דם, ובכך מספקת מידע למודולציה של מסלולים ספציפיים למטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת נתונים פנוטיפיים ברזולוציה מרחבית המגשרים בין ממצאים in vitro לבין תוצאות פונקציונליות במודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של אקטיבציה, נדידה ושכפול של פיברובלסטים בהקשר של רקמה בתלת-ממד, ובכך מבהירה תרומות ברמת המסלול לפרוסס של פיברוזיס.
- סריקה: מייצרת פלטי דימוי כמותיים (צפיפות פיברובלסטים, יישור, מורפולוגיה) המתאימים לניתוח בתוכן גבוה (high-content analysis) במערכי סריקה של תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בניתוח מורפומטרי וסטטיסטי מרחבי של רשתות פיברובלסטים, ומאפשרת השוואה בין גנוטיפים, פגיעות ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקה של פיברובלסטים ללוחות זמנים של עיצוב מחדש של החדרים (ventricular remodeling), ובכך תומכת בתיקוף פרה-קליני המותאם לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה לבירוח רקמות (tissue clearing) והדמיה שניתנת לשימוש חוזר, ומיושמת על מודלים מרובים של מחלות קרדיווסקולריות ועל סוגי תאים מעבר לפיברובלסטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתפקוד פיברובלסטים על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה המקורית ושלמות האות הפלואורסצנטי.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בחיתוך וצביעה, ובכך מפחית את השונות בזרימת העבודה ומגביר את הספיקה עבור פנוטיפ 3D.
- ערך אסטרטגי: משפר את הביטחון בקבלת החלטות של go/no-go על ידי חשיפת תגובות פיברובלסטים ממוקדות-מטרה המנבאות תוצאות תפקודיות במודלים של אי-ספיקת לב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות אנטי-פיברוטיות מותאם-סיכון, בהתבסס על מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה פנוטיפית המהושלים מרחבית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח לב של עכברים, קיבוע בפרפוזיה וטכניקות להבהרת רקמות המבוססות על הידרוגאל.
- תלוי בגישה לציוד אלקטרופורזה פעיל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותמיסונות הרכבה של RIMS/גליצרין.
- מחייב סטנדרטיזציה של משך זמן ההבהרה והטמפרטורה כדי למנוע בהרה יתרה או פלואורסצנציה עצמית ברקמה פגועה.
- התאמה למודלי מחלה אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של זמן הפיגמנטציה להפחתת רקע שמקורו ב헴, מבלי להחליש את אות ה-GFP.
- מגבלה מעשית: יציבות הדמיות לטווח ארוך תלויה בשיווי משקל נכון של RIMS כדי למנוע חוסר התאמה במקדם השבירה ודגרדציה של האות.
