ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית
9 בפברואר 2021
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.
הפרוטוקול שלנו מתאר את השימוש בביוזנסור מי חמצן בנוירונים וזחלים של דגי זברה בתרבית. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים לנתח את תפקידם של מיני חמצן תגובתי בפיזיולוגיה נורמלית ופתופיזיולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי בזמן אמת של מי חמצן בבעלי חיים ותאים תרבותיים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על בעלי חיים אחרים, כמו מערכת מודל מכרסמים. כדי להכין את ה-coverslips, יש להשתמש בכיסויים מנוקים בחומצה המאוחסנים ב-100% אתנול. השתמש מלקחיים כדי להסיר כיסוי אחד ממכל האחסון, ולהצית אותו כדי להסיר אתנול שיורית.
אוויר לייבש את הכיסוי לחלוטין על ידי הצבת אותו בזווית בתוך צלחת תרבות 35 מילימטר. הכן פולי-די-ליבין או PDL, או פתרון עבודה. החל PDL למרכז של כל coverslip, הימנעות התפשטות של הפתרון לקצוות דגירה PDL במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
ודא PDL לא להתייבש. לשטוף את PDL עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים ולתת את הצלחות להתייבש לחלוטין. הכן פתרון עבודה למין.
ולהחיל אותו על המרכז של כל coverslip, הקפדה למנוע את התפשטות הפתרון לקצוות. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך שעתיים עד שש שעות, למנוע ייבוש של תמיסת למין. כדי לבצע ניתוח עובר בתאי גנגליון רשתית צלחת או RGCs, להכין ולתייג ארבע מנות תרבית רקמה 35 מילימטר ולמלא אותם עם ארבעה מיליליטר של 70% אתנול.
E2 מדיה אחת. E2 מדיה שתיים. ותקשורת E2 שלוש, ביום הניתוח.
שמור את הכלים במקרר. כאשר עוברי זברה הם 34 שעות לאחר ההפריה, לקחת את מנות התרבות מצופה למינצין מתוך האינקובטור. ולשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של 1X PBS.
לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים ארבעה מיליליטר של ZFCM + מדיה לכל צלחת תרבות. הימנע ייבוש הצלחת. מחזירים את מנות התרבות בקירור המוכנות ומניחים להן להשתוות לטמפרטורת החדר.
מלא ארבעה עד שישה צינורות PCR עם 15 מיקרוליטרים של ZFCM + מדיה. לאחזר עוברי זברה מן האינקובטור לטבול עוברים בצלחת תרבית רקמה 35 מילימטר המכיל 70% אתנול במשך 5-10 שניות כדי לעקר אותו. באמצעות העברה של פיפטה, להעביר עוברים E2 מדיה מנה אחת, המכיל מדיה סטרילית E2 לשטוף אתנול עודף.
לאחר מכן, להעביר את העוברים ל E2 מדיה שתי צלחת ולהסיר chorions שלהם עם מלקחיים חדים. לבסוף, להעביר עוברים E2 מדיה שלוש צלחת לבצע ניתוחים. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, למקם ולהחזיק עוברים לפני החלמון עם אחד המלקחיים.
ולהסיר את הזנב האחורי לשק החלמון עם המלקחיים האחרים. תפוס את הצוואר עם מלקחיים ולהוריד את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים למדיה E2. עם קצה של מלקחיים עדינים, בעדינות לגלגל את העיניים מהראש תוך החזקת רקמת הגולגולת למטה עם מלקחיים שניים.
העבר ארבע עיניים לאחד הצינורות שהוכנו בעבר המכיל ZFCM + בעדינות triturate למעלה ולמטה עם p20 פיפטה על 45 פעמים כדי לנתק תאים. העבר את ה- ZFCM+ עם התאים המנותקים למרכז ה- coverslips. לשמור על תרבויות על הספסל העליון ב 22 מעלות צלזיוס על מתלה קצף פוליסטירן לספוג תנודות.
ביום ההדמיה, בדוק תאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסונים RGC. להדמיית תאים חיים, העבירו את הכיסויים מתבשיל התרבות לתא הדמיה של תא חי. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במסנן אדום OG-590 Longpass אובייקטיבי DIC ומצלמת EMCCD.
לפני ההדמיה, החלף את ZFCM + בינוני עם ZFCM-לאחר מיקום התאים עם המטרה 10X, לרכוש תמונות בהגדלה 60X באמצעות מטרת טבילה בשמן. השתמש בהגדלה נוספת של פי 1.5. ראשית לרכוש תמונות DIC.
לאחר מכן, תמונה roGFP2-Orp1, באמצעות ערכת המסננים המתאימה. לאחר לקיחת הסט הראשון של תמונות, להחליף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש לשנות את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויי pH ו- osmolarity.
להדמיית vivo, יש לשמור על עוברים לאחר הפריה 22 עד 24 שעות במדיה E3, המכילים 0.003% פניל תיוראה ללא כחול מתילן. להחליף מדיה ולהסיר עוברים מתים מדי יום. בגיל הרצוי, הרדמה והרה עוברים ב 1%agarose על 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות תרבות.
עוברים יכולים להיות מכוונים דרך הגב, דרך הפה, או לרוחב, בהתאם לאזור העניין להדמיה. לאחר שהאגרוז מתגבש, ממלאים את הכלים במדיית E3 ללא מתילן כחול, אך עם 0.016% טריקאין. הגדר את המיקרוסקופ להדמיה.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר הפוך כדי לדמות עוברים המותקנים בתחתית טיפת אגרוז. לרגש roGFP2-Orp1, ולרכוש תמונות תואמות עם מסנני הפליטה הרצויים. לרכוש z-ערימות עם עובי סעיף חמישה מיקרו מטר דרך החלק הרצוי של העוברים.
לאחר ההדמיה, להסיר עוברים מ Agarose עם מלקחיים עדינים ולשמור אותם באינקובטור ומתילן כחול מדיה חופשית עם פניל thiourea עד הגיל הרצוי. תמונה מייצגת של ביוסנסור מי חמצן ואקסונים מורחבים של דגי זברה RGC בתרבית מוצגת כאן. גוף התא, האקסון וקונוסי הגדילה נראים בבירור בנוירונים בודדים.
התוספת של מי חמצן למדיה התרבותית מגדילה את ערכי היחס, מראה כי שינויים בזמן אמת ניתן לזהות עם מערכת זו. כימות של רמות מי חמצן מוצג בפאנל B.To לקבוע את רמות מי חמצן בעוברים זברה שלמים, mRNA הוזרק במהלך שלב התא אחד, גורם לכל הרקמות לבטא את biosensor roGFP2-Orp1. האזור הראשי של זחלי זברה מוצג בשתי נקודות זמן שונות, תוך התמקדות ברמות מי חמצן ברשתית.
רמות הבסיס של מי חמצן בעוברים של דגי הזברה ביומיים שלאחר ההפריה וחמישה ימים לאחר ההפריה נמדדו. ביומיים שלאחר ההפריה, ערכי היחס היו נמוכים משמעותית מחמישה ימים לאחר ההפריה. יתר על כן, כל בעל חיים הראה רמה שונה של עלייה בתכולת מי חמצן הרשתית שלהם.
שימוש במלקחיים עדינים להסרת העיניים ניתוק עדין של העיניים עם פיפטה הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה על ידי טיפולים תרופתיים כדי לחקור את הגורמים המעורבים איתות ROS.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לדימות רמות של מי חמצן (H2O2) תוך-תאיים בנוירונים של דגי זברפיש בתרבית ובאלמנטים שלים של לרוות, תוך שימוש בביוסנסור המקודד גנטית roGFP2-Orp1. השיטה מאפשרת זיהוי בזמן אמת של דינמיקת H2O2 במהלך ההתפתחות, ובכך מסייעת לחקר מיני חמצן רבתיים (ROS) בפיזיולוגיה נוירונלית ובאמבריוגנזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נוירוביולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- דימיון תאי
רקע
- מיSuggested species של חמצן ראקטיבי (ROS), כולל H2O2, ממלאים תפקידים מכריעים באיתות תאי, התפתחות והומאוסטזיס.
- עלייה חולפת ברמות H2O2 נצפתה במהלך השלבים המוקדמים של העוברים בדגי zebrafish.
- שיבוש של NADPH oxidase (NOX), מקור מרכזי ל-H2O2, פוגע בהתפתחות מערכת העצבים ומשפיע על התמיינות תאי העצב של הרשתית (RGC) ועל צמיחה אקסונלית.
- מדידה מדויקת ובזמן אמת של H2O2 ברקמות חיות חיונית להבנת תפקודי ROS.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול חסון לדימוי H2O2 בנוירונים ובלריאות של דגי זברה באמצעות roGFP2-Orp1.
- מתן אפשרות לזיהוי רציומטרי בזמן אמת של H2O2 בתאים וברקמות ספציפיים במהלך ההתפתחות.
- אספקת פלטפורמה לחקירת תפקידם של ROS בתהליכים נוירונליים ועובריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת כיסויות (coverslips) מנוקות בחומצה ומצופות ב-PDL ובלמינין עבור תרבית נוירונים.
- דיסקציה ודיסוציאציה של תאי גנגליונים ברשתית (RGCs) של דגי זברפיש מעוברים 34 שעות לאחר ההפריה.
- ביטוי זמני או יציב של הביו-סנסור roGFP2-Orp1 בנוירונים בתרבית ובחילת עוברים באמצעות הזרקת mRNA.
- דימיג של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופים הפוכים ומיקרוסקופיה קונפוקלית, תוך ביצוע אנליזה רציומטרית של פלואורסצנציית הביו-סנסור.
- תיקוף תגובת החיישן באמצעות הוספה של H2O2 אקסוגני וכימות שינויים ביחס הפלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- roGFP2-Orp1 מאפשר ויזואליזציה של H2O2 בתאי RGCs של זביות בשיטחה, עם הדמיה ברורה של גופי תאים, אקסונים וקונוסי צמיחה.
- H2O2 אקסוגני מעלה את ערכי היחס של הביוסנסור, מה שמאשר את היכולת לגילוי בזמן אמת.
- הדמיה של העובר השלם חושפת שינויים התפתחותיים ברמות H2O2 ברשתית, עם יחסי ערכים גבוהים יותר בחמישה ימים לאחר ההפריה בהשוואה לשני ימים.
- נצפתה שונות בין-אינדיבידואלית בתכולת H2O2 ברשתית בין העוברים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לדימות כמותי בזמן אמת של H2O2 בנוירונים ובזחליים של דג הזבראפיש.
- ניתן להתאימו למחקרים ספציפיים לרקמה או לסוג תאים באמצעות גישות טרנסגניות.
- מתודולוגיה זו תומכת במחקרי סיגנלינג של ROS במהלך ההתפתחות הנוירונלית והעוברית בחולייתנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות כמותי של תאים חיים לבדיקת דינמיקת מימן פראוקסיד (H2O2) במהלך התפתחות עצבית מאפשר הפחתת סיכונים מכנית של מסלולי איתות רדוקס בשלבי הגילוי המוקדמים. גישת הביוסנסור הרציומטרית תומכת בביטחון ניבוי באישור מטרות ובחקירה פונקציונלית של מסלולים, במיוחד עבור מודלים של מחלות נוירו-התפתחותיות ומחלות המודעות לרדוקס. יכולת זו מחזקת את הרצף התרגומי מהביולוגיה של שלב הגילוי ועד לבחירת מודלים פרה-קליניים בתיקי מחקר ופיתוח של ביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של שילודי אותות המתווכים על ידי ROS במהלך התמיינות עצבית וצמיחה אקסונית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרים רגישים לחמצון המעורבים בתהליכים של התפתחות עצבית.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות כימות תנודות של H2O2 בתאים ורקמות חיים.
- מספק פלטפורמה להערכת מודולציה גנטית או פרמקולוגית של מסלולי ROS.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאות רציומטריות (ratiometric) מהימנות להערכה כמותית של רמות H2O2 תוך-תאיות.
- מאפשר תנאי בדיקה הניתנים לשחזור לסריקת תרכובות המכוונות לביולוגיה של חמצון-חיזור (redox).
- תומך ביכולת הרחבה ובסטנדרטיזציה עבור זרימות עבודה של דימיג'ינג בעל תוכן גבוה (high-content imaging).
- מפחית ארטיפקטים הנובעים משונות בביטוי גנים או משינויים בנפח התא, ובכך משפר את מהימנות הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לדימות in vivo של זחלי Zebrafish שלמים.
- מקל על רצף בין בדיקות תאיות למודלים של אורגניזמים לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות דינמיקת ROS בהקשרים התפתחותיים רלוונטיים.
- מספק בסיס להתאמה בין-מינית למודלים של מכרסמים כאשר הדבר מוצדק.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו לדימות תאים חיים משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לתיקוף מודלים פרה-קליניים, ובמיוחד עבור מסלולים של התפתחות עצבית ומסלולים המוכתבים על ידי רדוקס.
- ביולוגיית גילוי: מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של מעורבות ROS בדיפרנציאציה נורונית ובהכוונת אקסונים.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות וניתנות לשחזור להערכת מודולטורים של אותיות H2O2.
- אנליטיקה: מספקת מדידות פלואורסצנציה רציומטריות להשוואה חסונה בין תנאים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מודלים תאיים למודלים של אורגניזם שלם, ובכך תומך בהתאמת סממנים ביולוגיים ובהמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר הניתנת להתאמה לסוגי תאים, רקמות ורקעים גנטיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במיקוד של מסלולי חמצון-חיזור ומצמצם עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מנstandardיז פרוטוקולי דימות של תאים חיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתוני ROS כמותיים בזמן אמת במערכות הרלוונטיות למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של נכסים מווסתים-רדוקס ותוכניות תרגומיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימוי תאים חיים, טיפול בדגי zebrafish ובטכנולוגיית חיישנים ביולוגיים (biosensors).
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת ולתשתיות אנליטיות.
- נדרש תיקנון חוצב-צוותים של פרוטוקולי דימוי ומסלולי עיבוד נתונים.
- התאמה לאורגניזמי מודל אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה ותיקוף של הפרוטוקול.
- שלבים קריטיים כוללים דיסקציה מדויקת של הרקמה ודיסוציאציה עדינה של תאים כדי לשמור על חיוניות התאים ועל איכות הנתונים.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Primary Retinal Ganglion Cell Culture Derived from Zebrafish Embryos
4:45
In Vitro ROS Imaging of Cultured RGC Neurons
6:13
In Vitro ROS Imaging of Developing Embryos
7:40
Results: H2O2 Imaging in Cultured and in Vivo Zebrafish RGCs with roGFP2-Orp1
8:53
Conclusion
