הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן
6 בנובמבר 2021
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.
שלום, וברוכים הבאים לסרטון הזה של ג'וב. אנחנו רוצים להציג בפניכם את ההתקנה שיש לנו כאן ליצירת רשת מהירה, מחקר שנפתר בזמן שאנחנו מפתחים בלידס. שימו לב שזו לא מערכת סטנדרטית, אבל אנחנו מקווים שאם תיתן לכם תיאור מפורט של כל הדברים והפרמטרים שאנחנו עושים, תוכלו לפתח מערכות דומות במעבדות שלכם.
תיאור מפורט של המכשיר ניתן בפרוטוקול ריצ'מונד. כאן, אנחנו הולכים לתת מדריך צעד אחר צעד להכנת רשת מהירה EM נפתר זמן. מניסיוננו, ריכוז החלבון צריך להיות שני מיליגרם למיליליטר ומעלה. הפרוטוקול דורש נפח מינימלי של כ-50 מיקרוליטרים.
הפעל את ההתקן. לאחר מכן הפעל את מחשב הבקרה והפעל את תוכנת הבקרה. אתחל את כל משאבות המזרק על-ידי לחיצה על לחצן האתחול בכל משאבת מזרק.
הפעל את ספק הכוח של פוטנציומטר, הגדר אותו לתשעה וולט והפעל את תוכנת בקרת האוסצילוסקופ. גז חנקן בלחץ נדרש כדי ליצור את התרסיס. פתח את גליל החנקן והגדר את הלחץ ל-2 ברים.
ודא שכל שסתומי משאבת המזרק נמצאים במצב עומס. כדי לעשות זאת, לעבור את כל השסתומים לוותר בתוכנת הבקרה ולאחר מכן בחזרה לטעון. הגדר את כל המזרקים לאפס.
יש להסיר בשלב זה את כל בועות האוויר הקיימות במערכת. כדי לעשות זאת ייתכן שיהיה צורך לפתוח את המזרקים, להסיר בועות באופן ידני, והמזרקים רכובים שוב כאשר אינם מכילים בועות נוספות. מערכת הטיפול בנוזלים מאוחסנת בדרך כלל במים.
לפני טעינת המדגם, המערכת היא מכויל עם חוצץ. זה נעשה על ידי שטיפת הצינורות עם עודף של חוצץ. מניחים צינור המכיל לפחות 200 מיקרוליטרים של חוצץ על מזרק אחד.
החלק העליון של הצינור חייב להיות פירסינג כדי לחבר אותו. שאפו כמות מתאימה של חוצץ, בין 50 למאה מיקרוליטרים עם מזרק אחד באמצעות תוכנת הבקרה. תחליף שסתום אחד לוותר.
מחלקים את כל הנוזל במזרק אחד. החזר שסתום אחד למיקום העומס, ולחץ על כפתור האתחול על מזרק אחד כדי להכין את המערכת למחזור לשטוף הבא. צעדים אלה חוזרים בדרך כלל שלוש פעמים כדי להבטיח כביסה יסודית של הצינורות.
לאחר מכן, זרבובית הריסוס ממוקמת. הנח רשת EM בזרוע הצלילה. מקם את הרשת מול זרבובית הריסוס.
החל מאגר באמצעות תוכנת הבקרה. אם זרבובית ורשת מיושרים, נוזל צריך להצטבר לאחר ריסוס במשך תקופה ממושכת של זמן. במידת הצורך, להתאים את מיקום הזרבובית ולאחר מכן לבדוק שוב איפה הנוזל מצטבר על הרשת.
לאחר מכן, להתאים את המיקום של האתאן. קצה פינצטה צריך להגיע בערך למרכז האתאן. בצע הרצת בדיקה כדי לוודא שכל ההגדרות נכונות.
סגור את תא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי. שאף את נפח המאגר הנדרש לריצה בודדת למזרק אחד.
תחליף שסתום אחד לוותר. התחל את ההפעלה על-ידי הקשה על הפעל בתוכנת הבקרה. בדוק כי משאבת מזרק אחד נע, שתי שניות במקרה זה, והרשת צוללת לאחר עיכוב מתאים, 1.5 שניות כאן.
כאשר הריצה מסתיימת, הגדר את הלחץ על זרוע הבוכנה לערך הרצוי. לחץ על OK'in תוכנת הבקרה כדי לשחרר את הלחץ מזרוע הצלילה. עכשיו האתאן קרירה ומלאה באתאן נוזלי.
תזרים את הרשתות לפני השימוש. פריקה זוהרת טיפוסית היא 90 שניות ב-10 מיליאמפר באוויר של 0.1 מיליבר. לאחר מכן, הצינורות מכוילים עם דגימה.
אם נפח הדגימה הזמין נמוך, ייתכן שהצינורות ישוללו עם נפח מת אחד בלבד. דגימת שאיפה. בדרך כלל הנפח המת הוא סביב 30 מיקרוליטרים.
תחליף שסתום אחד לוותר. מחלקים את הדגימה דרך צינורות וזרבובית. לאחר מכן שאף את כמות המדגם הנדרשת להפעלה אחת.
תחליף שסתום אחד לוותר. בדוק שהלחות היחסית הגיעה לערך הרצוי. בדרך כלל אנו מכינים רשתות ב- 60% ומעלה.
זה יכול לקחת כמה דקות. מניחים את פינצטה מחזיקים רשת זוהרת בזרוע צוללת. מקם את שקופית הפוטנציומטר במצב ההתחלה, מוכן למדידת מהירות.
הגדר את הגורם המפעיל למדידת המהירות בתוכנת האוסצילוסקופ. מניחים את האתאן הנוזלית, וקרוב לתא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי.
התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה. בסיום הריצה, לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי לשחרר לחץ מזרוע הצלילה. פתחו את תא הלחות, שחררו את הקשר בין זרוע צוללת לפינצטה.
התקדם בזרוע הצוללת תוך שמירה על הרשת באתאן נוזלי. לאחר מכן להעביר את הרשתות לחנקן נוזלי לאחסון. שמור את מדידת האוסצילוסקופ.
אפס באופן ידני את המיקום של המחוון והבולסן של potentiometer. חזור על הפרוטוקול כדי להכין רשתות שכפול. ניסויים שנפתרו בזמן נעשים באופן דומה.
ריכוזי מלאי גבוהים יותר נדרשים לניסויים שנפתרו בזמן בגלל דילול בשלב הערבוב. לניסוי שנפתר בזמן, השתמש בכל שלושת המזרקים. הצינורות מחוברים למשאבות המזרק ולזרבובית הריסוס.
זרבובית הריסוס המיקרופלואידית המשמשת כאן מכילה גם אלמנט ערבוב. שים לב כי צינורות ארוכים יותר ייתן נפח מת גדול יותר וצעדי שיווי משקל כביסה דורשים יותר חוצץ ודגימה. ישילב את כל המזרקים עם חוצץ ודגימה בנפרד.
בדרך כלל, מזרק אחד משמש לדגימה A ומזרקים שתיים ושלוש משמשים לדגימה B'לאחר הצינורות הוא שיווי משקל, לטעון מדגם A לתוך מזרק אחד לדגום B לתוך מזרקים שתיים ושלוש. לאחר מכן, לעבור שסתומים אחד עד שלושה לוותר. התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה.
שים לב שנדרש קובץ Script אחר של הפעלה עבור ניסוי שנפתר בזמן. עיכובים שונים בזמן ניתן להשיג בשתי דרכים. על ידי התאמת מהירות הבוכנה, ניתן לשנות את עיכוב הזמן מערבוב להקפאה.
מהירות צלילה מהירה יותר תוביל לעיכוב זמן קצר יותר. לחלופין, מרחק האתאן ספריי משתנה על ידי התאמת המיקום האנכי של זרבובית ספריי. הגדלת המרחק תגרום לעיכוב זמן ארוך יותר.
במיקרוסקופ האלקטרונים בהגדלה נמוכה, רשת טיפוסית נראית כך. אזורים של קרח דק, כאמור, מתאימים לרכישת נתונים. בהגדלות גבוהות יותר, חלקיקים צריכים להיות גלויים בבירור.
עם דגימת בדיקה כגון אפופריצין, ערכת נתונים קטנה יחסית מרשת אחת מספיקה לשחזור ברזולוציה של שלוש עד ארבע אנגסטרום. עבור ניסויים שנפתרו בזמן, אנו אוספים ערכות נתונים מנקודות זמן או רשתות שונות. זה שימושי כדי לשלב את הנתונים עבור סיווג 3D ולאחר מכן לעקוב אחר חלקיקים בחזרה לנקודות הזמן שלהם.
בדרך זו הנתונים יכולים לספק מידע מבני ומידע על קינטיקה התגובה. לסיכום, אנו מקווים שנהניתם מהסרטון. אנו מקווים כי עם התיאורים המפורטים בעיתון JoVE יחד עם הווידאו, תוכל לערוך ניסויים משלך באמצעות ייצור רשת מהירה, אשר הוכח כדי להקל על חלק מהבעיות ממוטציה או כדי לעזור עם אינטראקציות בממשק מי האוויר, כל מה שאתה צריך כדי לנהל מחקרים פתורים בזמן שלך כדי לנסות ללכוד כמה מאותם מצבים שאינם שיווי משקל.
אז, רשת שמחה עושה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להכנה מהירה של רשתות במיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-EM), תוך התמקדות הן בהכנה סטנדרטית ומהירה של רשתות והן בניסויים בעלות רזולוציה זמןית. השיטה המתוארת משתמשת במכשיר ייעודי שפותח במעבדה ומאפשר הכנת רשתות בתוך מילי-שניות, דבר המקל על לכידה של מצבי ביניים קצרי חיים בתגובות חלבונים. הפרוטוקול תוכנן להיות נגיש עבור חוקרים השואפים לפתח מערכות דומות או לערוך מחקרי cryo-EM בעלות רזולוציה זמןית.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית (cryo-EM)
- ביולוגיה מבנית
- טכנולוגיית הכנת דגימות
רקע
- מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (Cryo-EM) מתקדמת במהירות הודות לשיפורים בחומרה ובאלגוריתמים לעיבוד נתונים.
- שיטות מסורתיות להכנת דגימות, כגון blotting, מוחלפות בטכניקות מהירות יותר כמו פיזור פיזואלקטרי, הדפסת סיכות (pin printing) וריסוס ישיר.
- הכנה מהירה של רשתות היא חיונית עבור Cryo-EM ברזולוציית זמן, ובכך היא מאפשרת את חקירתם של מצבים מולקולריים חולפים.
- האתגרים כוללים ניהול של עובי הקרח ואופטימיזציה של השימוש בדגימה.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול שלב-אחר-שלב להכנה מהירה של רשתות cryo-EM ברזולוציית זמן באמצעות מכשיר מותאם אישית.
- מתן אפשרות לחוקרים לשחזר או להתאים את השיטה למעבדותיהם.
- סיוע בחקר תגובות ביוכימיות מהירות על ידי לכידה של מצבי ביניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה ואתחול של התקן מותאם אישית להכנה מהירה של רשתות, הכולל משאבות מזרק ופיית ריסוס מיקרופלואידית.
- השגת שיווי משקל של המערכת עם בופר והוצאת בועות אוויר מהצינורות.
- טיפול ברשתות EM באמצעות פריקה זוהרת (Glow-discharging) לפני יישום הדגימה.
- כיול מדויק של פיית הריסוס, הרשת וכוס האתאן להקפאה אופטימלית.
- בקרה אוטומטית על חלוקת הדגימה, הריסוס וההצלילה לאתאן נוזלי.
- ניסויים ברזולוציית זמן באמצעות מספר מזרקים לערבוב מהיר של ריאקטנטים לפני ההקפאה.
- כוונון של השהיות זמן באמצעות מהירות הבוכנה ומיקום הפייה.
תוצאות עיקריות
- ניתן להכין רשתות באמצעות כמות דגימה קטנה של 50 µL בריכוזים של ≥2 mg/mL עבור ארבע רשתות.
- ההשהיה בין יישום הדגימה להקפאה יכולה להיות קצרה עד 10 ms.
- ניסויים ברזולוציית זמן מאפשרים ללכוד תוצרי ביניים של תגובה על ידי שינוי זמני ההשהיה בין הערבוב להקפאה.
- הרשתות המתקבלות מתאימות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה, כאשר דגימות בדיקה הניבו שחזורים ברזולוציה של 3–4 Å.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר הכנה מהירה ועקבית של רשתות cryo-EM, ותומך במחקרים סטנדרטיים ובמחקרים בעלי רזולוציה זמנית (time-resolved).
- חוקרים יכולים להתאים את המערך המתואר כדי לפתח התקנים עצמאיים להכנה מהירה של רשתות.
- גישה זו פותחת הזדמנויות חדשות לחקר תהליכים ביולוגיים דינמיים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנת רשתות מהירה עבור cryo-EM מאפשרת ללכוד מצבים מולקולריים חולפים, דבר המשפיע ישירות על שלבי הגילוי המוקדמים ועל הפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח בביופארמה.&ד. על ידי צמצום הזמן מרגע ערבוב הדגימה ועד להקפאה לזמן קצר של עד 10 מילי-שניות, גישה זו מאפשרת ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה של תוצרי ביניים קצרי חיים, ובכך תורמת לתיקוף מטרות ולזיהוי מובילים. השחזוריות והגמישות של הפרוטוקול ממצבות אותו כיכולת ניתנת להרחבה עבור צינורות גילוי תעשייתיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר בביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של קונפורמציות דינמיות של חלבונים ומתווכי תגובה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת מצבים מבניים חולפים הרלוונטיים לתפקוד.
- מסייע בביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין רשתות cryo-EM מתוקפות המתאימות לסריקה מבנית בתפוקה גבוהה.
- מספק תוצאים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מאפשר הערכה מהירה של שינויים מבניים בחלבונים המושרים על ידי תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים תצלומיות מבניות למנגנונים רלוונטיים למחלה לצורך רצף תרגומי.
- תומך בקידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת נתונים ברזולוציה גבוהה על מצבים תפקודיים.
- מאפשר שילוב של תובנות מבניות בבחירת מודלים פרה-קליניים ובאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה להכנה מהירה של רשתים מתאים לשלבים שבין הגילוי הראשוני ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), ותומך בתהליכי עבודה המבוססים הן על השערות והן על סריקות בביולוגיה מבנית.
- ביולוגיה של גילוי: מאיצה את בדיקת ההשערות על ידי לכידה של מצבים שאינם בשיווי משקל לצורך בהירות מכניסטית.
- סריקה: מספקת רשתות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך ניתוח cryo-EM והערכת תרכובות בשלבים הבאים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של שינויים מבניים וקינטיקה של תגובות לאורך נקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור בין תוצרי ביניים מבניים לתוצאות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פרוטוקול מודולרי וסתגלן למערכות חלבונים שונות ולעיצובים ניסיוניים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת רשתות, המשפרת את השחזוריות והיכולת להרחבה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) באמצעות אספקת נתונים מבניים ברזולוציה גבוהה ובדיוק זמני.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות המהוות תיקוף מבני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במכשור cryo-EM ובטיפול בדגימות.
- נדרשת גישה למערכות פיזור מיקרופלואידיות, בקרות תזמון מדויקות ותשתית קריוגנית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת איכות רשתים הדירה ויכולת השוואה של נתונים.
- ניתן להתאמה למערכות חלבונים שונות, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של ריכוז הדגימה ועובי הקרח.
- עובי קרח מוגבר במהירויות גבוהות יותר עלול להגביל את איכות הנתונים עבור יישומים מסוימים.
