איסוף נתונים מיקרוסקופי תאורה מובנה קריו מתאים שהשתמרו בהקפאה

שיטה זו מאפשרת הדמיית הקפאה ברזולוציית-על על תאים ביולוגיים שלמים כדי לזהות במדויק מבנים תאיים. ניתן להשתמש בו גם בשילוב עם שיטות אחרות כחלק מזרימת הדמיה מתאמת. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי הדמיה ברזולוציית סופר יכול להיעשות במהירות בתנאים קריוגניים באמצעות פלואורופורים קונבנציונליים ומנות אור נמוכות יחסית.

CyroSIM הוא כלי רב עוצמה המספק תובנה להבנת דינמיקת האולטרה-מבנה התאי בתגובה לרמזים פנימיים או חיצוניים. היישום שלה כולל ייצור חיסון והתגלגלות, בקרת איכות, מעקב לאחר השוק, הנדסת נוגדנים ואופטימיזציה, כמו גם אפיון חלקיקים ננו. דגימות תמרון בתוך שלב ההקפאה לוקח בפועל כדי להבטיח את הבטיחות של הרשת.

מומלץ גם להכיר את הפקדים בחלון תא הטייס לפני איסוף הנתונים. כדי להתחיל, להסיר את המכסה מן Dewar החיצוני של שלב ההקפאה ויוצקים חנקן נוזלי מסונן עד שהוא כרבע מלא. המתן עד שהרתיחה הראשונית שוככת לפני השופכים יותר וממלאים את הכלי כשני שליש מלאים.

החלף את המכסה בזהירות, הצבעה על הזרבובית מן המטפל כמו חנקן נוזלי רותח החוצה. לאחר שהחנקן הנוזלי יפסיק לצאת מהשקע, הנח את צינור השקע מעל הבמה דיואר על במת הקריו. חבר את מקור החשמל, חבר את כבל ה- USB וחבר את Dewar החיצוני לשלב.

לאחר מסירת חנקן נוזלי, לחץ על כפתור השחרור בשלב הקריו כדי לאפשר לו להיכנס לתא המדגם ולחכות 30 עד 45 דקות עד שהמערכת תתקרר ותתייצב לפני תחילת רכישת התמונה. השתמש במקש ההקס בכלי הקלטת כדי לפתוח את שתי הלוחות של קלטת ההעברה לדוגמה. פתח את הלוחות רחבים מספיק כדי להפיל את הרשת בין שתי הצלחות, אך אל תפתחו למיקום המרבי.

השתמש במלקחיים ארוכים כדי להרים את תיבת הרשת לדוגמה מתוך החנקן הנוזלי. סובבו אותו כך שהחרוך יתיישר עם מיקום האחסון בתוך הבמה והנחו אותו על הבמה. השתמש בהתקן המתאים כדי לפתוח את מכסה תיבת האחסון למיקום הדגימה הנכון.

באמצעות מלקחיים הפוכים, הסר את רשת TEM ממחזיק המדגם, טבול אותה בתוך החנקן הנוזלי והבטיח שצד סרט הפחמן יוצב כך שבסופו של דבר הוא יעמוד מול המטרה על גשר המדגם ויפיל אותה למיקום בקלטת ההעברה לדוגמה. סגור את המחסנית לדוגמה באמצעות מקש הכיוה בכלי הקלטת. השתמש בנקודת המגנט בכלי הקלטת כדי להרים ולהרכיב את המחסנית המכילה את הרשת על הגשר לדוגמה.

שמור אותו שקוע או קרוב לחנקן הנוזלי ובכיוון הנכון. מניחים את הקלטת שטוחה בתוך סיכות המיקום של הגשר ודחוף אותה בעדינות כדי להבטיח שהיא תתוקן. סגור והסר את תיבת האחסון יחד עם כל הדוגמאות הנותרות.

הזז את פתח המכסה בשלב ההקפאה לתנוחת ההדמיה וכבה את אור תא הדגימה. החלק את הבמה לכיוון האופטיקה כדי ליישר אותה מתחת לעדשה האובייקטיבית, ולאחר מכן שחרר בעדינות את המטרה למיקום באמצעות הידית, והבטח שהיא נחה בתוך המכסה של שלב ההקפאה, אך אינה נוגעת בה. לכסות את הבמה ואת אופטיקה עם וילון שחור אטום, ולאחר מכן להפעיל את תוכנת הבקרה קוקפיט על מחשב cryoSIM. לחץ על לחצן מצב הקריאה עבור כל מצלמה והגדר אותו ל- CONV3 מגה-הרץ.

בדוק כי הטמפרטורה של כל מצלמה היא 80 מעלות צלזיוס וכי מאוורר המצלמה כבוי. הפעל את המצלמה המוחזרת, תחת אור, בחר סביבה ותחת linkam, בדוק את המחזק ולאחר מכן לחץ על לחצן מצב הווידאו. בחלון התצוגה Mosaic, הקטן את התצוגה כדי לראות את מיתאר הרשת.

לחץ על חפש שלב אם לא ניתן לראות אותו ומרכז את הרשת על ידי לחיצה כפולה שמאלה באמצע העיגול. השתמש במקשים למעלה ולמטה כדי למקד את המדגם עד שסרט התמיכה ברשת או כל תכונה רלוונטית אחרת נמצאת במוקד. השתמש בתשעה ובשלושת המקשים בלוח המספרי כדי לשנות את שלב Z.

לאחר שהבמה ממורכזת, בטל את מצב הווידאו. אסוף פסיפס אור גלוי על ידי לחיצה על Run Mosaic בתצוגת הפסיפס כדי לייצר אריחים של תמונות אור נראות לעין המסתובבות כלפי חוץ מהמרכז. שמור את התצוגה על-ידי לחיצה על שמור פסיפס.

בדוק את פסיפס שדה בהיר לצד כל תמונות מפת פלואורסצנטיות קודמות על ידי כיבוי אור הסביבה ואת המרוכז, כמו גם את מצב הווידאו, ולאחר מכן הפעל את לייזר העירור הנדרש ובחר את המצלמה והמסנן המתאימים, בתחילה ב 50 מילי וואט לזמן חשיפה של 50 אלפיות השנייה. הקש אפס כדי להצמיד תמונה וכוכב כדי ליצור ניגודיות אוטומטית. לחלופין, כווננו ידנית את הניגודיות באמצעות המחוון בתחתית התמונה.

לאחר שנמצאו תאים מעניינים ביולוגית עם פלואורסצנטיות מתאימה, סמנו את מיקומם באמצעות לחצן אתר הסימן בתצוגת Mosaic. המשך לסמן את כל האתרים הפוטנציאליים לפני שתתחיל ברכישת תמונה. שמור מחדש את הפסיפס עם האתרים המסומנים על-ידי לחיצה על שמור אתרים בקובץ.

כדי לתפור את תמונת הפסיפס באמצעות תוכנת stitchEm, גרור ושחרר את קובץ פסיפס הטקסט לתוך קובץ stitchEm עם הסיומת BAT ולשמור את תמונת TIF המשולבת של אריחי הפסיפס באותה תיקיה. לשמירת תמונה עם האתרים המסומנים, גרור ושחרר את קובץ טקסט הפסיפס ואת קובץ הטקסט של הסמנים לתוך הסמל בו-זמנית. הגדר את זמן החשיפה ללייזר בהתבסס על הספירות ועל הטווח הדינמי בתמונת הפלואורסצנטיות בתחתית חלון תצוגת המצלמה.

בחר באיזה מסנן להחיל ולמטב את ההגדרות עבור כל אורך גל של נורית עירור לשימוש, הפעלת כל לייזר בנפרד. לחץ על שתי המצלמות כדי להפעיל אותן. חזור לאחד האתרים המסומנים והתמקד שוב בעומק הרצוי.

לאחר התמקדות באזור עניין, צא מהמוקד באמצעות מקש החץ למעלה בחלון XY בשלב המאקרו כדי לבחור את הגובה של מחסנית Z לרכישה ולחיצה על שמור למעלה. צא מהמוקד באמצעות מקש החץ למטה, לחץ על שמור למטה ולאחר מכן עבור למרכז, ודא שהתמונה עדיין במוקד. בחלון תא הטייס בחר ניסוי באתר יחיד.

מהרשימה הנפתחת בחר תאורה מובנית. שנה את גובה הערימה כך שיהיה שווה לגובה Z בתוספת מיקרומטר אחד. הזן את זמני החשיפה באלפיות שניה עבור לייזרי 405 ו- 488 ננומטר בשורה העליונה עבור המצלמה המוחזרת ואת זמני החשיפה ללייזרים 561 ו - 647 ננומטר בשורה התחתונה עבור המצלמה המשודרת.

הזן שם קובץ ולחץ על עדכון כדי להפיק קובץ חדש המכיל את התאריך והשעה מבלי לעקוף את הקבצים הקודמים, ולאחר מכן לחץ על התחל. אם החנקן הנוזלי Dewar ממלא מחדש את שלב ההקפאה במהלך רכישת התמונה, בטל את התהליך על ידי לחיצה על לחצן ABORT בתוכנת תא הטייס. בכל תנוחה, לאסוף Z-מחסנית באמצעות אור גלוי על ידי כיבוי הלייזרים והפעלת אור הסביבה ואת המעיבות.

תחת ניסוי של אתר יחיד, בחר Z-stack והגדר את אור הסביבה לחשיפה של 20 אלפיות השנייה, תוך שמירה על גובה Z. חזור על תהליך זה עבור כל האתרים המסומנים. לאחר סיום ההדמיה, בטל את עגינה של הבמה והסר את כל הדגימות.

כבה את האור של תא הדגימה. נתק את Dewar החיצוני decant כל חנקן נוזלי שנותר לתוך מיכל אחר קריו תואם, המאפשר Dewar לחזור בבטחה לטמפרטורה נורמלית. המתינו עד שהאפשרות לאפות את תצוגת קריו-בימת הופכת לזמינה לאחר שלא נשאר עוד חנקן נוזלי בשלב Dewar.

לחץ על כפתור האפייה כדי להיכנס למצב החימום. שים את תקע המכסה על במת ההקפאה. הרזולוציה ב- cryoSIM גבוהה משמעותית מזו במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית סטנדרטית.

מפת הפלואורסצנטיות ממיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי קונבנציונלי יכולה לשמש לאיתור תחומי עניין להדמיה וניתן להשיג את תמונת cryoSIM המתאימה ממיקום ברשת. מדגם המכיל תאי U2OS היה מוכתם בתערובת של צבע ציטוסקופי מיקרוטובול ירוק וצבע מיטוכונדריה אדום וכתוצאה מכך הכתים את רכיב המיקרוטובול של הציטוסקלטון והמיטוכונדריה. הדמיה מאוחרת יותר הראתה לוקליזציה של המיטוכונדריה בתוך התא, כמו גם את הסידור של microtubules, הדגשת המסגרת המבנית שהם מספקים לתא ואת ההרכבה של cytoskeleton סביב אברונים.

תהליך שחזור ה- SIM יכול לייצר חפצים שניתן לזהות באמצעות SIMCheck, תוסף imageJ בחינם. מפת ניגודיות אפנון זו שנוצרה באמצעות SIMCheck מציגה אזורים של ניגודיות אפנון נמוכה בתוך אזור הגרעין, מה שמצביע על כך שאזור זה הולך להיות רגיש יותר לשחזור חפצים. החץ הלבן מציין חפץ שחזור.

בעת ניסיון פרוטוקול זה להבטיח כי המדגם נשאר שקוע או קרוב חנקן נוזלי בכל עת, כדי למנוע דה-vitrification. כמו כן לשים לב זמני חשיפה וספירה בטווח הדינמי, שכן זה משפיע על איכות הנתונים ומונע נזק לייזר לדגימה. לאחר הדמיית קריו, ניתן לדמיין את אותן דגימות עם שיטות אחרות כגון טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות, שיש לנו כאן ב- B24 Beamline.

על ידי שילוב תמונות cryoSIM עם תמונות המכילות מידע מבני על התא, אנו יכולים לענות על שאלות מרכזיות נוספות על מבנה אולטרה-מבנה ותפקוד תאיים.