שיטות כמותיות לחקר חלבון ארגינין מתילטרנספראז 1-9 פעילות בתאים
7 באוגוסט 2021
פרוטוקולים אלה מספקים את המתודולוגיה המשמשת להערכת הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMT) בתאים. הנחיות מפורטות על הערכת פעילות PRMT באמצעות סמנים ביולוגיים אנדוגני אקסוגני, מתיל ארגינין זיהוי נוגדנים, ותרכובות כלי מעכב מתוארים.
מטרת הליך זה היא למדוד את הפעילות האנזימטית של חברים בודדים במשפחת החלבון ארגינין מתילטרנספראז בתאים. הפעילות נמדדת על ידי קביעת רמות מתילציה ארגינין שלהם ואת הרמות הכוללות של חלבון ביו סמן באמצעות סופג פלואורסצנטי כמותי המערבי. היתרון של השיטה המתוארת הוא הביצועים הפשוטים בכל מעבדה עם תרבות תאים ויכולות כתם מערביות פלואורסצנטיות.
ההנחיות המפורטות לגבי סמנים ביולוגיים, נוגדנים ומעכבים שתי תרכובות מסופקים במאמר. וכאן תיארנו צעדים מכריעים המעורבים בהליך הניסויי. ואת ההליך מוצג עבור 24 פורמט היטב.
ראשית, הכינו מאגר תמוגה, הוסיפו קוקטייל מעכבי בנזונז וחלבון טרי לפני השימוש. הסר את כל המדיה מבארות. לשטוף עם 100 מיקרוליטר PBS, ולהוסיף 60 microliters של מאגר תמוגה לבאר.
דגירה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, נדנדה את הצלחות כדי להפיץ את מאגר התמוגה על התאים. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 20%SDS כדי למצוא ריכוז של 1% ולערבב על ידי טלטול עדין. מעבירים את הליזאט לצינורות אפנדורף ושומרים אותו על הקרח.
קבעו את ריכוז החלבון של הדגימות שלכם באמצעות ערכת בדיקה של חלבון BCA, או השתמשו בכל שיטה אחרת שסובלת מ-1%SDS בתמיסה. לאחר התאמת ריכוז החלבון עם מאגר תמוגה להיות שווה על פני הדגימות ב 20 microliters של ארבע פעמים טעינת מאגר 60 microliters של ליזאט התא, וחום ב 95 מעלות במשך חמש דקות. התוספת של בנזונאס למאגר תמוגה במהירות הידרוליזה חומצות גרעין, אשר להפחית צמיגות ליזלת התא.
ליסטים עם בנזונז אינם צמיגים. Lysates ללא בנזונס יש גוש גדול של DNA דביק כי לא גלולה כאשר סובב. טען ל-5 עד 20 מיקרוגרם של ליסט התאים הכולל לחלבוני היסטון, ו-20 עד 100 מיקרוגרם לחלבונים אחרים בג'ל חלבון שיפוע של 4 עד 12 ביס-טריס.
סביב הג'לי בסחבות כחוצץ שמסביב במשך כשעתיים ב 100 וולט, או עד צבע העמסה הכחול מגיע לתחתית הג'ל. אם אתה מבצע העברה רטובה, להרכיב את כריך ההעברה במאגר העברת טריס-גליצין קר כקרח. הפעל קרום PVDF על ידי השרייה במתנול וג'ל שיווי משקל במאגר העברה במשך 30 שניות לפני ההרכבה.
מניחים נייר מסנן ספוגים, קרום PVDF וג'ל על פי הוראות היצרן. מעבירים חלבונים במאגר העברת טריס-גליצין ב-70 וולט למשך 1 עד 1.5 שעות על קרח. לאחר ההעברה, דגירה הממברנה במשך 30 דקות בחסימה חוצץ.
יש לשטוף עם חיץ שטיפה, ולהדגיר עם נוגדנים ראשוניים במשך הלילה בארבע מעלות. למחרת, לשטוף קרום שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף, דגירה עם נוגדנים משניים שכותרתו פלואורסצנטית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף שלוש פעמים במשך חמש דקות עם חוצץ לשטוף. מניחים את הממברנה עם הפנים כלפי מטה על צלחת הזכוכית של הדימוי הכתם המערבי הפלואורסצנטי.
מכסים עם יריעת הגומי ומסירים את כל בועות האוויר. קרא את האות ב-700 ו-800 ננומטר. לאחר סיום הסריקה, עבור אל התמונה והתאם אות ערוץ 700 ו- 800 כדי לראות רצועות בבירור.
כאן אות ערוץ 700 המוצג כאדום מייצג את רמות החלבון הכוללות, ואות ערוץ 800 המוצג כירוק מייצג את רמות החלבון המתילציה. לאחר מכן, עבור אל ניתוח ובחר קריאה חציונית עליונה ותחתונה. למדידת עוצמת הרצועות, בחרו בכלי מלבן ציור וציירו את הצורה סביב הרצועות שברצונכם לכמת.
עבור לצורות שבהן אתה מוצא עוצמות של 700 ו- 800 ערוצים. העמודה הנקראת אות מספקת רמות אינטנסיביות עם רקע מופחת. ניתן להעתיק את התוצאות ישירות לקובץ Excel.
הנה הדוגמה המציגה את הניתוח של פעילות PRMT1 בתאים על עיכוב עם מעכב מסוג PRMT אחד MS023. פעילות PRMT1 נמדדת על ידי קביעת רמות דימתילציה אסימטרית H4 היסטון H4. כאן, רמות המתילציה, הרצועות הירוקות יורדות באופן תלוי מינון, בעוד שרמות ההיסטון הכוללות של הרצועות האדומות נשארות ללא שינוי.
כדי לקבוע תרכובת IC50, להתוות את הלוגריתם של ריכוז מעכבים נגד histone H4 ארגנין-3 רמות דימתילציה אסימטרי מנורמל לרמות histone הכולל ואחריו ניתוח התאמה לא ליניארית. השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי כפול אחראי וניתן לשחזור של פעילות החלבון מתיל טרנספראז בתאים. היתרון של השיטה הוא שהיא משתמשת במתודולוגיית סופג מערבית ידועה הנגישה למעבדות אקדמיות וניתן לשנותה בקלות בהתאם לציוד המעבדה.
פרטי ההסתעפות כולל חלבוני סמן ביולוגי, נוגדנים ושתי תרכובות כימיות עבור כל בן משפחה PRMT בודדים מסופקים במאמר.
סקירה כללית
מחקר זה מתווה שיטה להערכת הפעילות האנזימטית של משפחת ה-Protein Arginine Methyltransferase (PRMT) במערכות תאיות. באמצעות מדידת רמות מתילציה של ארגינין, הפרוטוקול כולל הנחיות לשימוש בביומארקרים ספציפיים וב-western blotting פלואורסצנטי כמותי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- בדיקות ביוכימיות
- מדידת פעילות אנזימטית
- מסלולי איתות תאיים
רקע
- חברי משפחת ה-PRMT ממלאים תפקידים מכריעים בתהליכים תאיים.
- הבנת תפקידם חיונית להבהרת מנגנונים ביולוגיים שונים.
- ייתכן ששיטות קיימות אינן ספציפיות מספיק עבור PRMTs בודדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- Western blotting פלואורסצנטי כמותי
- מערכות תרביות תאים
- בדיקות עיכוב עם תרכובות כלי ספציפיות
תוצאים עיקריים
- הדגמה של כימות מהימן של הפעילות האנזימטית של PRMT.
- מתן תובנות לגבי השפעתם של מעכבים ספציפיים על פעילות PRMT1.
- תיקוף של המתודולוגיה לשימוש במעבדות אקדמיות.
מסקנות
- המחקר מציע גישה סטנדרטית להערכת פעילויות PRMT.
- מתודולוגיה זו נגישה למגוון מסגרות מחקר, ובכך היא מקדמת חקירה נוספת של תפקודי PRMT.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של פעילות אנזימטית של PRMT בודד בתאים נותנת מענה לצורך קריטי בתיקוף מטרה והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. גישה זו מאפשרת הערכה חסונה של מתילציה של ארגינין כסמן ביולוגי פונקציונלי, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בחקירת מסלולים ובהערכת תרכובות. הנגישות והשחזוריות של השיטה מקלות על שילובה בקווי מו"פ בקנה מידה ארגוני לצורך מיון וקידום פורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות ישיר של פעילות PRMT כדי להבהיר את המעורבות של המטרה ואת המודולציה של המסלול.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין תרומות של PRMT בודדים באמצעות ביומרקרים של סובסטרט מאומתים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרה ובבדיקת היפותזות מכניסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות תאיים שעברו תיקוף עבור סריקת מעכבים ופרופיל תרכובות בשלבים הבאים.
- מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים באמצעות western blotting פלואורסצנטי לצורך פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור.
- מאפשר תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ומוכנים לפלטפורמה לצורך הערכה מהימנה של מודולטורים של PRMT.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בדיקות של סמנים ביולוגיים למתילציה עם מודלים תאיים רלוונטיים למחלה לצורך רצף טרנסלציונלי.
- תומכת בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים על ידי אספקת קריאות כמותיות של מודולציה למטרה.
- מספקת הפחתת סיכונים מנגנונית עבור בחירת מועמדים פרה-קליניים כאשר פעילות PRMT מעורבת במסלולי מחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מציבה את המדידה הכמותית של פעילות PRMT בנקודת המפגש שבין גילוי מוקדם, זיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני, ובכך מאפשרת זרימה רציפה של נתונים לאורך כל רצף המחקר והפיתוח (R&D).
- ביולוגיה של תגליות: מספקת בדיקה חסונה של השערות והבהרה של מסלולים באמצעות מדידה ישירה של מתילציה של ארגנין.
- סריקה: מספקת תוצאי בדיקה כמותיים הניתנים לשחזור, המתאימים לאפיון מעכבים ולמיון תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני עוצמה מנורמלים עם הפחתת רקע לצורך ניתוח השוואתי של פעילות PRMT בתנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי התגליות לשלבים הפרה-קליניים על ידי התאמת בדיקות של סמני ביולוגים למערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה מודולרי וניתן להתאמה לשימוש חוזר על פני חברי משפחת ה-PRMT ומודלים תאיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות PRMT.
- ערך תפעולי: מסנכרן ומייעל את מדידת הפעילות של PRMT לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים כמותיים ברי-ביצוע.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של נכסים המכוונים ל-PRMT תוך התאמה לסיכונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, Western blotting ודימות פלואורסצנטי כמותי.
- נדרשת גישה לנוגדנים מאושרים, סובסטראטים של סממנים ביולוגיים ומכשור דימות תואם.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הבדיקה ותהליכי ניתוח הנתונים בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למודלים תאיים שונים, אך התוצאות תלויות בספציפיות של הנוגדנים ובבחירת הסובסטראט.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות תגובת-בסיס צולבת של נוגדנים וחפיפה של סובסטראטים, דבר הדורש תיקוף קפדני.
