קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין
18 בספטמבר 2021
אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.
הגישה שלנו מאפשרת לנו לבצע את הניתוח הכמותי של התפלגות אספרגילוס פומיגטוס קונידיה בריאת עכבר מנוקה אופטית בהר שלם. אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה יכול לחדור למערכת הנשימה ולגרום למחלות מסכנות חיים בחולים אימונו-קום. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים.
כל דור מאופיין במבנים שונים של קירות דרכי הנשימה ואוכלוסיות תאי החיסון. בענפי הסימפונות, אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה יסולקו על ידי אישור רירית. עם זאת, בשטח הפנוי, הסיווג הרירי לא עובד וקונידיה חייבת להיות מנוקה על ידי תאי החיסון, כגון מקרופאגים מכתשיים ונויטרופילים.
כמו גם ההיבטים הזמניים המרחביים של התפלגות Conidia בנתיבי הנשימה חשובים. עם זאת, לא נחקר כראוי שאלה בהבנת מנגנוני המחלה. כאן אנו מציגים מערך ניסיוני לניתוח כמותי של הפצת אספרגילוס פומיגטוס קונידיה בנתיבי הנשימה של עכברים נגועים.
אני מורח 50 מיקרוליטרים של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה על עכבר. שש שעות לאחר מכן, לקצור את הריאה. תקן לילה ב-2% פורמלדהיד וכתם עם תווית של סטרפטאבידין מצומדת.
ואז לחשוף את הדגימה לסליקה האופטית. מניחים את הדגימה בבקבוק הזכוכית המלא בתמיסת מי מתנול 50% ומניחים אותה על מערבל הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה. החלף 50%מתנול עם 100%מתנול ולשים אותו מתחת למיקסר מדגם במשך שעתיים.
הכן תערובת המורכבת מאלכוהול בנזיל חלק אחד, ושני חלקים של בנזיל-בנזואט. מעבירים את הדגימה אליו 24 צלחת היטב ומכסים אותה בתערובת בנזיל-בנזואט במשך 30 דקות לפחות. הדגימה מוכנה להדמיה.
הנח את הדגימה על מחזיק הדגימה. ומניחים את המחזיק במיקרוסקופ. לאחר הפעלת מערכת המיקרוסקופ ופתיחת התוכנה, הפעל את נורית השידור ובחר מטרת X.
אתר באופן חזותי את הדגימה שלך ברמזור השידור והמשיך לכרטיסיה רכישה. בחר מצב מיקרוסקופיה לייזר קונפוקלית למבדה. תדליק את הלייזרים המתאימים.
הגדר את הטווח הספקטרלי של הגלאי ובחר את המראה הדיכרואית. התאם את רווח הגלאי וצמצם את חור הסיכה ליחידת אזור אחת. הגדר את רזולוציית הפיקסלים ל- 512 על 512.
הפעל את מצב מחסנית zed והתחל הדמיה חיה. מצא את מישור המוקד שבו שתי הקוביות גלויות. הרחיבו את החלונית zed-stack.
באמצעות גלגל המיקוד, מצא ובחר את המישורים הנמוכים והגבוהים ביותר של המדגם. מקם את מישור המוקד ליד תחתית המדגם. כבה את מצב מחסנית zed והגן את מצב הסריקה בחיוג.
במידת הצורך, התאם את מיקום X, Y ואת מספר האריחים. הפעל מצבי סריקת zed-stack וחיוג. הגדר את שלב חתך הזיד לחמישה מיקרונים.
הגדר את מהירות הסריקה. תתחילו בניסוי. ההדמיה אורכת בדרך כלל מספר שעות בהתאם לגודל הקרקע ומהירות הסריקה.
התמונה המתקבלת אינה מעורבת באופן ספקטרקטיבי. עבור ביטול ספקטרלי, השתמש באפשרות אי-חצייה ליניארית. בחר את האזורים המתאימים לשטחי הקרקע המסומנים בסטרפטבידין וקונידיה.
תתחיל להתיר את ההפחדה. לאחר ביטול ההמהה שמור את הקובץ הלא מעורב. כדי לתוחם אריחים מהתמונה המתקבלת, פתחו את התמונה.
בחר שיטות, תפירה גיאומטרית. בחר את התמונה בחלון הקלט. באפשרויות תפירה, בחרו באפשרות 'אריחי פלט ונתיך' חדשים.
השתמש במצב הפניה עם ערוץ נבחר המתאים לפלורסצנטיות דרכי הנשימה. פתחו את התמונה בתצוגת תלת-ממד עודפת. במידת הצורך, שנה צבעים המשמשים למצגת שלהם.
כאן אנו מציגים ערוץ דרכי הנשימה בגוונים אפורים ואת ערוץ Conidia בסגול. ליצירת מסיכת דרכי הנשימה, השתמשו בהוספת כלי משטח חדש. בחר ערוץ דרכי הנשימה ובחר את פרמטר ההחלקה של 10 מיקרון.
ניתן להשתמש במסננים שונים כדי לא לכלול אות דרכי הנשימה. ראשית, בדוק חזותית את פני השטח והגדר את סף העוצמה. מסננים נוספים, כמו שטח הפנים ניתן להחיל גם על דרכי הנשימה הנבחרות באופן בלעדי, אבל לא pleura או כלי דם.
לאחר מכן, מחק באופן ידני את שבר פני השטח שנבחר שאינו שייך לדיבי הנשימה. עכשיו אתה יכול להתבונן במשטח שנוצר ולחקור את החלקים החסרים כדי לתקן אותם מאוחר יותר. צרו מסיכה למשטח הנשימה באמצעות אפשרויות עריכה ומסווה של הכל.
בחר את ערוץ דרכי הנשימה והגדר תאי עבודה מחוץ לפני השטח ל- 0.001. כאן הראינו את המסכה המתקבלת בכתום. שמור ערוץ Conidia ומסכת דרכי הנשימה בשתי תיקיות נפרדות, כמו T של סדרת F.
פתח את הקובץ עם תמונת מסיכת דרכי הנשימה. הפוך את התמונה ל בינארית. בצע תהליך בינארי, הפוך בינארי.
כדי להידמות לעובי המסיכה, יש למרוח מספר פונקציות תלת-ממד מתרחבות. עקוב אחר תוספים, תהליך, להרחיב 3D. באפשרותך גם להשתמש בפונקציונליות פקודות מאקרו כדי לעשות זאת.
לאחר מספר מחזורים של תהליך התרחבות, השתמש בפונקציית חורי המילוי. בצע תהליך, בינארי, מילוי חורים. כדי למלא את שאריות החורים במסכה באופן ידני, פתח את אזור מנהל העניין.
עקוב אחר ניתוח, כלים, מנהל ROI. בעזרת הכלי בחירת מצולע בחר אזור שיש למלא בהקרנה מסוימת אחת. בצע זאת מספר פעמים עבור תחזיות מעטות בערימת zed, כך שתוכל לבצע אינטרפולציה של צורות של אזורי העניין.
כדי לבצע אינטרפולציה של הצורות הנבחרות, בחר את כולן ולחץ על עוד, אינטרפולציה של עלות עלה על 30. ואז למלא את כל ROIs עם לבן. השתמש בהליך חורי המילוי שוב.
כדי להרכיב מחדש את עובי המסיכה בחזרה לאחר מילוי החורים, יש למרוח את הפונקציה 3D השחוקה. עקוב אחר תוספים, תהליך, לשחוק 3D. אתה יכול גם להשתמש micros בשביל זה.
מספר האיטרציות ב- 3D ו- LA 3D צריך להיות שווה. הפעל את יישום ספירת קונידיה. לחץ על לחצן הוספת קבצים ובחר את התיקיות עם קבצי DIFF עם מסכת דרכי הנשימה המוכנות ותמונות פלואורסצנטיות Conidia.
הגדר סף מותאם אישית בין אפס לאחת. לחץ על אישור וראה את התוצאות. באמצעות גישה זו, אנו מבצעים את הניתוח הכמותי של הקונידיה בתוך ומחוץ לעץ הסימפונות של עכברים שש שעות לאחר יישום Conidia.
הנתונים מצביעים על כך שעל פי היישום המקורי שלנו, רוב Conidia לחדור את שטח alveola שהוקצה שם בתחילת התגובה החיסונית הדלקתית. הדמיה תלת מימדית של ריאות העכבר עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקל מאפשר זיהוי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה דרכי הנשימה. עיבוד של תמונות תלת מימדיות באמצעות פרוטוקול זה מאפשר לבצע ניתוח כמותי של התפלגות Conidia בתוך ומחוץ לענפי הסימפונות.
הגישה שלנו יכולה גם להיות מנוצלת כדי להעריך את הקינטיקה של חיסול Conidia מן הבריחים של עכברים ולהשוות התפלגות Conidia אנטומית בעכברים אימונונו-קומנטיים immunocompromised. בנוסף, באמצעות גישה זו, ניתן לנתח את ההתפלגות של חלקיקים או חלקיקי ננו agglomerates דרכי הנשימה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לניתוח כמותי של התפלגות קונידיות של Aspergillus fumigatus בדרכי הנשימה של עכברים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לנתח התפלגות של מיקרו-חלקיקים וצבירי ננו-חלקיקים במצבים פתולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מיקרוביולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- Aspergillus fumigatus עלול לגרום למחלות נשימה חמורות, במיוחד בקרב אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת.
- דרכי הנשימה מורכבות ממעברים בעלי מבנים שונים ואוכלוסיות משתנות של תאי מערכת החיסון.
- פינוי ריסתי-רירי (Mucociliary clearance) הוא מנגנון ההגנה העיקרי נגד קונידיות שנשאפו.
- באזורים מסוימים, תאי מערכת החיסון, כגון מקרופאגים אלבולריים ונויטרופילים, ממלאים תפקיד מכריע בפינוי קונידיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה כמותית לניתוח פיזור קונידיות של Aspergillus fumigatus בריאות עכברים.
- שיפור ההבנה של התנהגות הקונידיות במערכת הנשימה.
- אספקת תובנות לגבי התגובה החיסונית נגד פתוגנים שנשאפו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הבהרה אופטית של ריאות עכבר בשיטת Whole-mount.
- ניתוח כמותי של התפלגות קונידיה.
- הערכה של מבני דרכי הנשימה ואינטראקציות של תאי מערכת החיסון.
- יישום השיטה עבור מיקרו-חלקיקים וצבירי נאנו-חלקיקים.
תוצאים עיקריים
- השיטה מאפשרת ויזואליזציה וכמות של התפלגות קונידיות בדרכי הנשימה באופן יעיל.
- הממצאים מדגישים את תפקידן של תאי מערכת החיסון בפינוי קונידיות ממסלול הנשימה.
- ניתן להתאים את הטכניקה למחקר של חלקיקים אחרים במודלים פתולוגיים.
- התוצאות תורמות להבנת הדינמיקה של זיהומים בדרכי הנשימה.
מסקנות
- השיטה שפותחה מהווה כלי בעל ערך לחקר זיהומים פטריות במערכת הנשימה.
- התובנות שיושגו עשויות לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות עבור אוכלוסיות בסיכון.
- מחקרים עתידיים יוכלו להרחיב מתודולוגיה זו ליישומים רחבים יותר בתחום בריאות הנשימה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
שיטה זו מאפשרת ניתוח מרחבי כמותי של התפלגות פתוגנים ברקמות שעברו שקיפות (clearing) במצבם השלם (whole-mount), ובכך היא תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף של מטרות לתרופות אנטי-פטרייתיות. על ידי אספקת מיקום בתלת-ממד ונתונים קינטיים על פינוי קונידיה, היא מספקת ביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים של הגנת מאחוס עם מערכת חיסון לקויה. גישה זו משפרת את הרצף התרגומי משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של תרפיה המכוונת למאחוס או כזו המכוונת לפתוגן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות מיקום הקונידיות במדורים ברונכיאליים לעומת אלבולהריים.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי זיהוי דפוסים מרחביים של אינטראקציה בין תאי מערכת החיסון לפתוגן.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה הדימיוני בתלת-ממד הניתן לשחזור, להפחתת עמימות מכניסטית במחקרי מאבח-פתוגן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים של עומס קונידיה בתוך ומחוץ לעצי סימפונות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר דימות בר-הרחבה ותואם למולטיפלקס של פתוגנים המסומנים פלואורסצנטית באיברים שלמים שעברו שקיפות.
- ערך תפעולי: מסייע לשחזור הבדיקה באמצעות שלבי שקיפות אופטית, צביעה והפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) סטנדרטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הדינמיקה של התגובה החיסונית המוקדמת לבין קינטיקת סילוק הנפתגן במודלים של מערכת חיסון תקינה לעומת מודלים של דיכוי חיסוני.
- ערך מדעי: תומך בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי הקשר בין התפלגות מרחבית של קונידיות לבין גיוס תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורך של פינוי קונידיות לצורך קבלת החלטות מותאמות סיכון בשלבי ההתקדמות במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בזרימות עבודה של ביולוגיית גילוי על ידי אפשור בדיקת היפותזות מרחביות והבהרת מסלולים במודלים של זיהום ריאתי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מנגנוני התחמקות ממערכת החיסון באמצעות מיפוי תלת-ממדי כמותי של התפלגות קונידיה.
- סריקה: מספקת דגימות רקמה סטנדרטיות המוכנות לבדיקה, עם קריאות פלואורסצנציה כמותיות לסריקת תרכובות או גנוטיפים.
- אנליטיקה: מספקת מערכי נתונים תלת-ממדיים עם חתכי z ופירוק ספקטרלי (spectral unmixing), המאפשרים השוואה סטטיסטית של עומס הקונידיה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובות חיסוניות מולדות מוקדמות לבין תוצאות פרה-קליניות באמצעות מעקב מרחבי-זמני אחר הפתוגן.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לניתוח התפלגות חלקיקים (למשל, מיקרו-חלקיקים, ננו-חלקיקים) במודלים של מחלות נשימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות נוגדי פטריות באמצעות ויזואליזציה ישירה של אינטראקציות בין הפתוגן למערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מנרמל את עיבוד הריאות כדגם שלם (whole-mount) להשגת הדמיה תלת-ממדית בעלת תוכן גבוה וניתנת לשחזור בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתוני יעילות בעלי רזולוציה מרחבית במודלים של מאחסנים עם מערכת חיסון לקויה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרופית מותאם סיכון, המבוסס על פינוי פתוגנים ספציפי למדור אנטומי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקאלית, שקיפות אופטית (optical clearing) ותהליכי ניתוח תמונות בתלת-ממד.
- תלוי במיקרוסקופיית סריקה בלייזר עם יכולות הפרדה ספקטרלית (spectral unmixing) וריצוף תמונות (tiling) לצילום הריאה כולה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, שקיפות ומסיכה (masking) לצורך כימות בר-שחזור.
- התאמה למערכות מודל חלופיות עשויה לדרוש אופטימיזציה של משך השקיפות והתאמת מקדם השבירה.
- מגבלות מעשיות כוללות את זמן הצילום, המשתנה בהתאם לגודל הריאה ולמהירות הסריקה, כפי שצוין במקור.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Aspergillus fumigatus Conidia Application & Specimen Preparation
1:22
Mouse Lung Lobe Optical Clearing
2:23
Mouse Lung Lobe Imaging with CLSM
6:50
Image Processing: Surface Rendering
9:23
Image Processing: Mask Correction
12:54
Conidia Quantitative Analysis
13:41
Representative Results
14:07
Conclusions
