קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ומהירה למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של הגידול. הפרוטוקול חל באופן נרחב על אונקולוגיה תרגומית קלינית, ויסייע בשיפור הפרשנות האבחונית והמכניסטית של תפקיד המיטוכונדריה בהתפרצות ובהתקדמות הסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היישום של הומוגניזציה רקמות כדי לפשט את ההכנה ולמקסם את התשואה של המיטוכונדריה תוך צמצום מגבלות הדיפוזיה.

טכניקה זו מציעה יישומים פוטנציאליים בהגדרות קליניות ואבחון עם הערכה כמותית של תפקוד מיטוכונדריאלי הגידול באמצעות רקמת גידול ביופסיה או מובאת. התחל על ידי הצבת homogenizer זכוכית המכיל מיליליטר אחד של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי, או MiR05, עלה זכוכית מתאים היטב על קרח רטוב. מניחים את הרקמה במיליליטר אחד של פתרון שימור ביופסיה, או BIOPS, בצלחת פטרי קרה כקרח.

חותכים את הגידול לחתיכות קטנות של כ 5 עד 10 מיליגרם כל אחד, ומניחים את חתיכות הגידול הנותרות בחזרה ל 10 מיליליטר של BIOPS נשמר על קרח. לאחר ניפוח חלקי הרקמה בזהירות על נייר סינון, מניחים אותם על סירת שקילה קטנה עם זפת פלסטיק ומתעדים את המשקל הרטוב הראשוני. מניחים את החלקים שאינם בשימוש בחזרה לתוך הצינור החרוט 10 מיליליטר של BIOPS להמשך שימור.

שקועים בקטעי הרקמה בהומוגניזר קר כקרח המכיל MiR05 ומתעדים את המשקל הנותר על סירת השקילה. באמצעות עלה זכוכית עם טווח פינוי של 0.09 עד 0.16 מילימטרים, בעדינות לשבש את רקמת הגידול על ידי השלמת חמש עד שבע משיכות למטה ולמעלה. עבור כל משיכה, סובב את העלי בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון שלוש פעמים תוך דחיפת העלי כלפי מטה, ושלוש פעמים נוספות תוך משיכת העלי בחזרה למעלה.

אפשר לרקמה להתיישב לתחתית ההומוגניזר בין משיכות, אך הימנע מהבאת העלי במלואו מעל נפח הנוזלים כדי למנוע הקצפה. יוצקים את ההומוגנאט לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ומניחים אותו על קרח. פיפטה 1 עד 3 מיליליטר של MiR05 טרי מעל עלה לתוך homogenizer לשטוף כל רקמה הומוגנית שנותרה.

יוצקים את שטיפת MiR05 לתוך הצינור החרוט המכיל הומוגנטי. חזור על שלב זה פעמיים עד שלוש פעמים כדי להבטיח העברה מלאה של הומוגני. כדי לחשב במדויק את ריכוז הרקמה הומוגנית, בדוק בקפידה את homogenizer ואת הומוגנט עבור חומר לא הומוגני הנותרים, הכולל רקמת חיבור.

כדי להסיר את החומר הלא הומוגני מן homogenizer כי לא ניתן להגיע עם פינצטה, לאחר הוספת MiR05 הומוגניזר, לשאוף את הנפח, כולל הרקמה, עם pipette ולהעביר את התוכן לצלחת פטרי. הסר את החומר הלא הומוגני התיישב בחתיכות גדולות בתחתית הצינור חרוטי מן הומוגנט על ידי שאיפה אותם עם פיפטה, ומניחים אותם על מכסה הצינור חרוטי. הסר את הרקמה מצלחת פטרי או כובע צינור חרוטי עם פינצטה, ולהכתים אותו על נייר מסנן.

מוסיפים את ההומוגנית הנותרת מכובע הצינור החרוט בחזרה לצינור החרוט. כובע הצינור, ואז הפוך לערבב. לבחון מחדש את homogenizers הומוגניסט עבור כל חומר נוסף לא הומוגני, ולחזור על השלבים כדי להסיר חומר לא הומוגני במידת הצורך.

שקול ומתעד את המסה של החומר הלא הומוגני התאושש מן homogenizer. בדוק את ההכנה הומוגנית עבור כל רקמה שלם ברוטו הועבר, והסיר את החלקים שאינם הומוגניים ולשקול לפי הצורך. הפחת את משקל הרקמה התאושש מסירת השקילה, homogenizer, הומוגניאט מן המשקל הרטוב הראשוני כדי לחשב את משקל המדגם הסופי.

באמצעות משקל המדגם הסופי, להוסיף MiR05 נוסף כדי להביא הומוגנט לריכוז הרצוי. ברגע שההומוגנטים נשקלים ומוכנים, המשיכו לבצע את ההסתה בהקדם האפשרי. שמור את המדגם מאוחסן על קרח רטוב עד שהוא מועבר למכשיר.

לאחר המכשיר מכויל ואת המדגם מוכן, להסיר את פקקים עם תנועה מפותלת ולשאף MiR05 מן התאים, הימנעות הממברנה חשופה בתוך התא. מערבבים את הבאר הומוגנית, ומוסיפים 2.25 מיליליטר של הומוגנט לתא. נניח הומוגנט אחד מתווסף לתאים מרובים, pipette אחד מיליליטר של הומוגנט בכל פעם לתוך כל תא תוך ערבוב הומוגני כדי להבטיח התפלגות רקמות שווה.

לחץ על F4 כדי לתת שם וחותמת זמן של האירוע, ולאחר מכן לחץ על אוקיי. מלא מזרק 50 מיליליטר עם חמצן ממיכל חמצן עם וסת צינורות גז באמצעות מחט קהה 18 מד. הזריקו את החמצן ישירות לתאים כדי להגזים אותם לכ-500 חמצן מיקרומולרי.

הכנס באופן רופף את פקקים ולחכות לסגור עד החמצן מגיע כ 480 מיקרומולר. עם תנועה מפותלת, לסגור לאט את התא ולאפשר את הנשימה כדי שיווי משקל במשך כ 15 עד 20 דקות. מלאו את נימיו המרכזיים של הבלם ב-MiR05 במידת הצורך.

השתמש מיקרו מזרקים ייעודיים כדי להזריק מצעים, uncouplers, מעכבים לתוך תאים סגורים לחלוטין שם חותמת זמן האירועים עבור כל תא בזמן אמת. בחר F6 כדי להתאים את ריכוז החמצן ואת קשקשים שליליים שיפוע חמצן לפי הצורך. לאחר כל זריקה, לשטוף את המזרק שלוש פעמים במים עבור תרכובות מסיסות במים, ו 70% אתנול עבור תרכובות מומס אתנול.

מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של 0.8-טוחנת malate ולהמשיך מיד לזריקה הבאה. לשטוף את מזרק הזריקה שלוש פעמים במים. מוסיפים מיד חמישה מיקרוליטרים של פירובט 1-טוחן, ומחכים שהנשימה תתייצב.

לאחר שטיפת המזרק, להוסיף 10 microliters של 0.5-טוחנת ADP ולחכות תגובת ADP להתייצב. לשטוף את המזרק ולהוסיף חמישה microliters של גלוטמט 2-טוחנת ולחכות הנשימה להתייצב. לשטוף את המזרק, ולאחר מכן להוסיף חמישה microliters של 4 מילימולר cytochrome-C, ולחכות הנשימה להתייצב.

לאחר שטיפת המזרק, מוסיפים 20 מיקרוליטרים של תמציתי 1-טוחנת ומחכים להתייצבות הנשימה. טיטרט 0.5-1-microliter תוספות של FCCP 1 מילימולר ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה. המשך עד שלא תהיה עלייה נוספת בנשימה.

לשטוף את מזרק הזריקה שלוש פעמים ב 70%אתנול. הוסף שני מיקרוליטרים של רוטנון 150 מיקרומולר ולחכות הנשימה להתייצב. הוסף עוד מיקרוליטר אחד של רוטנון כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף.

אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה, ולאחר מכן לשטוף את מזרק הזרקה שלוש פעמים ב 70%אתנול. הוסף שני מיקרוליטרים של אנטימיצין 125 מיקרומולרי A ולחכות להנשימה להתייצב. הוסף עוד מיקרוליטר אחד של אנטימצין A כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף.

אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה. לשטוף את המזרק שלוש פעמים עם 70% אתנול. בדוק את ריכוז החמצן של התא.

אם הריכוז הוא מתחת 125-micromolar, reoxygenate לאוויר החדר, או hyperoxygenate קלות כדי להבטיח כי חמצן אינו מגביל את שטף הנשימה. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של אסקורבאט 0.8-טוחן. לשטוף את המזרק שלוש פעמים ב 70% אתנול.

הוסיפו מיד 10 מיקרוליטרים של TMPD 0.2-טוחנת, והמתינו לעלייה בנשימה. לאחר שטיפת המזרק עם אתנול, להוסיף 25 microliters של 4-טוחנת נתרן אזיד מיד כאשר שטף הנשימה של הרמות TMPD אסקורבט. סיים את על-ידי לחיצה על קובץ, שמור והתנתק.

זה נצפתה כי 40 מיליגרם למיליליטר של הומוגניאט רקמה הביא דלדול חמצן מהיר. צריכת החמצן הואטה באופן משמעותי עם 30 ו 20 מיליגרם למיליליטר של הומוגנייט רקמות, אבל עדיין ירד במהירות תוך זמן קצר בהיעדר מצעים או ADP. ריכוז 10 מיליגרם למיליליטר של הומוגנט רקמות הביא שיעור צריכת חמצן אופטימלי.

פרוטוקול SUIT שימש להערכת זרחן חמצוני הקשור ל- NADH ותמצית והעברת אלקטרונים, כמו גם פעילות מורכבת של IV. שחרור Cytochrome C הוערך בנוכחות פירובט ומלאטה, או תמציתי ורוטנון, שניהם גילו כי ההכנה הומוגנית לא פגעה במיטוכונדריה. נמצא גם כי זרחן חמצוני הקשור NADH היה זניח בגידולים EO771.

טיטורציה של FCCP כדי להניע זרימת אלקטרונים מקסימלית גילתה כי בגידולים EO771, זרחן, ולא חמצון, היה מוגבל לנשימה. פרופילי הנשימה ההומוגניים של הגידול היו דומים לאלה של תאי EO771 שאינם מושתלים, חד-מיניים, למעט העברת אלקטרונים מקסימלית מופחתת הנתמכת על ידי מצעים המקושרים ל- N ו- S בגידול. הקינטיקה הנשימתית של תמציתי הוערכו עוד יותר על ידי titrations צעדים של ADP תת רווי עד השיעור המקסימלי הושג.

הריכוז החצי מקסימלי של ADP בנוכחות תמציתי ורוטנון היה 37.5 מיקרומולר, בעוד השיעור המקסימלי היה כ 10.5 פיקומולים לשנייה, למיליגרם. מכשירים שהוקמו בטיפול שגרתי, כמו גם טיפול ברקמות, הם בעלי חשיבות קריטית להצלחת ניסויים אלה. בעקבות נהלים אלה, ניתן ליישם גישות אחרות ספציפיות להמוניה או לסמן כדי לדרג נורמליזציה על בסיס שאלת העניין.

האמצעים הנפוצים כוללים כימות חלבונים כולל ופעילות אנזימטית של סינתאז סיטראט, אך משתנים בהתאם למערכת המודלים, העיצוב הסטטיסטי ושאלת המחקר.