תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה
3 באוגוסט 2021
מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.
פרוטוקולים אלה נועדו לדגמן את ההשפעות במבחנה של שימוש בחמצן משלים על מיקרוביום הריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס. מתכון מדיה זה מותאם כדי לשקף את ההרכב הפיזיולוגי של כיח עבור אנשים החיים עם סיסטיק פיברוזיס. תהליך ההסתעפות מציג את היכולת לתרבות בתנאי חמצן שונים.
שינויים במדיום כיח מלאכותי מאפשרים לו לחקות מחלות ריאה כרוניות אחרות ולדגמן קהילות מיקרוביות בתנאים אחרים, כגון ריכוזי גלוקוז שונים בחולי סיסטיק פיברוזיס וסוכרת בו זמנית. סקירה של השלבים להכנת בינוני כיח מלאכותי מראה את הערבוב של ASCM מוכן, ASMM ו ASBM. חיץ הסכינים משמש לתפירת ה- pH ל- 6.3 ועיקור המסנן של המדיום מתבצע בחדר קר על שייקר מסלולית.
ראשית, להכין מדיום כיח מלאכותי על ידי הוספת 250 מיליליטר של ASCM לבקבוק ליטר אחד המכיל ASMM. לאחר מכן להוסיף 250 מיליליטר של ASBM לבקבוק בינוני. יש לתעד את המדיום עם מאגר טחון טוחן אחד בסיסי כדי להגיע ל-pH של 6.3 על נייר pH.
יש לשמור בקירור את מדיום הליחה המלאכותי בארבע מעלות צלזיוס עד לסינון. לאחר מכן כדי להתחיל את תהליך הסינון, להעביר 200 מיליליטר של מדיום כיח מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר. לאחר חיבור מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, ולאחר מכן מניח את התא על שייקר מסלולית, רועד ב 90 סיבובים לדקה בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס.
שנה את המסנן לאחר 350 מיליליטר של בינוני מקבל מסונן כדי להתגבר על בעיית סתימה. לאחר כמות ניכרת מסוננת, ב 150 מיליליטר נוסף מדיום לסינון. חזור על סינון עם תאים נוספים עד שכל המדיה מסוננת.
סקירה כללית של התזת חמצן המדגימה את התוספת של כיח המטופל למדיום כיח מלאכותי בבקבוק סרום אוטומטי. ואז לפחל את בקבוק הסרום האטום עם תערובת גז. לבסוף, בקבוק הסרום הוא דגירה כדי להשיג תרבות אלק ווטס במרווח של 24 שעות עבור רצף מטא גנומיקה הבאים.
כדי להתחיל בתרבית בקבוק סרום, סמן בקבוקי סרום אוטומטית 500 מיליליטר עם מזהי מדגם, תאריך ושעה של חיסון ואחוז חמצן היעד. בשכונה ביולוגית, הוסיפו 24 מיליליטר של מדיום הכיח המלאכותי לכל בקבוק סרום שמוקם. כדי להשיג נפח מדגם מספיק עבור כל מצב תרבית, במידת הצורך, לדלל את המדגם עם תמיסת מלח חוצץ פוספט סטרילי, ואז כיח הומוגני עם מחט 18 מד ולהוסיף מיליליטר אחד של כיח המטופל לכל בקבוק סרום.
לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית, מניחים את פקקי הגומי האוטומטיים על החלק העליון של כל בקבוק סרום, לוחצים על פקקי הגומי מבלי לגעת בחלק התחתון של המעצור. לאחר הסרת הבקבוקים מהמכסה המנוע, יש למרוח ולקמט את אטמי האלומיניום. מוציאים את גולת הכותרת של החותמות ומנגבים את החלק העליון של הבקבוקים עם ניגוב אלכוהול ומעבירים את אטם הבקבוק דרך להבת מבער בונזן.
עכשיו לתקן מחט סטרילית, 18 מד למזרק רשימת בוכנה עם מסנן, להכניס את מזרק שחרור גז מודבק לתוך הבקבוק הראשון. עכשיו לתקן מחט סטרילית, 18 מד לפלט הגז מהמערכת ולהכניס את מחט פלט הגז לתוך הבקבוק גם כן. לנתב את צמתי T מהמיכלים דרך צג החמצן.
לאחר אימות ריכוז החמצן היעד זורם דרך המערכת, היעד כחמישה ליטרים לדקה של זרימת גז. לנתב מחדש את צמתי T מהמיכלים עד לתפוקת הגז. כאשר הגז מתחיל לזרום דרך בקבוק הסרום, שימו לב למד הלחץ, ואם הלחץ עולה באופן בלתי צפוי, כבו את המערכת מיד.
לאחר ריצה, חמצן לדלג דרך בקבוק הסרום במשך דקה אחת ב 5 ליטר לדקה, ההגדרות מאפשרות 10 חילופי אוויר ולהבטיח את האטמוספירה הפנימית מגיעה לריכוז הרצוי של 100%חמצן. הסר את שחרור הגז, מחט 18 מד. לאחר מתן הלחץ בבקבוק הסרום לבנות לאטמוספירה אחת, מיד להסיר את מחט פלט הגז.
לדגור את בקבוקי הסרום 37 מעלות צלזיוס אינקובטור שייקר ב 150 סיבובים לדקה במשך 3, 24 שעות מרווחים. אלק ווטס נלקחים בכל מרווח של 24 שעות לניתוח במורד הזרם ודגימות מתנקמות בכל פעם. הדוגמה כאן מראה כיצד תרבות עשויה להיראות לפני ואחרי הדגירה.
רמות החמצן וה-pH של היציאה נמדדו במהלך תהליך התרבות של דגימות כיח שנשמרו ב-37 מעלות צלזיוס. עם שני מרווחי התכתשות של 12 שעות ו 24 שעות, ריכוזי חמצן נשמרו בערך לאורך זמן עם ירידה מתונה בריכוז חמצן שנצפתה בכל שלושת התנאים. רמות ה-pH הנמדדות היו בטווח הפיזיולוגי ללא שינויים משמעותיים לאורך זמן.
ההשוואה בין עומס מיקרוביאלי, גיוון והרכב קהילתי בין כיח לא תרבותי ותרביתי חשפה עלייה של פי 20 בעומס המיקרוביאלי בליחה בתרבית. מדדי גיוון הצביעו על שימור הרכב הקהילה עם הבדלים גלובליים מינימליים שהוצגו על ידי תהליך התרבות. ניתוח השוואתי של 120 מינים מיקרוביאליים בליחה תרבותית ולא תרבותית בוצע על ידי רצף מטא גנומי.
46 מינים אלה זוהו בדגימות לא תרבותיות ומתרביתות כאחד. בעוד 35 זוהו באופן בלעדי בדגימות לא תרבותיות ו -39 זוהו באופן בלעדי בדגימות תרבותיות. עקומות גדילה מבוססות סופג נוצרו עבור פתוגנים נפוצים של ריאות CF בתרבית במדיה כיח מלאכותית מדגם המטופל מבודד תחת ריכוז חמצן נורמלי 21%.
אין שינוי לאורך זמן בצפיפות האופטית ב 600 ננומטר ב ASM רק שליטה שלילית הצביעה על תרבות ללא זיהום. דפוסי עקומת הצמיחה הטיפוסיים שנצפו מצביעים על כך שניתן להשתמש במדיום ASM ליצירת עקומות צמיחה בשיטות אופטיות. הרצף המטגנומי משמש כאן לתיאור הרכב הקהילה המיקרוביאלית.
טכניקות אחרות כגון רצף metatranscriptomic ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי גנים או מטבולומיה כדי להעריך את ייצור מטבוליט.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת מודל לבחינת השפעות ההיפרוקסיה על קהילת המיקרוביום בדרכי הנשימה בסיסטיק פיברוזיס. הפרוטוקול עושה שימוש במדיום ליחה מלאכותי כדי לשחזר את הרכב הליחה, ובתנאי היפרוקסיה כדי לדמות את השפעות החמסן המשלים על המיקרוביום של הריאה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוביולוגיה
- בריאות נשימתית
- מחקר על סיסטיק פיברוזיס
רקע
- מטופלים עם סיסטיק פיברוזיס חווים לעיתים קרובות שינויים במיקרוביום של הריאות.
- מתן חמצן משלים עשוי להשפיע על קהילות המיקרובים בריאות.
- מצע ליחה מלאכותי תוכנן כדי לדמות את התנאים הפיזיולוגיים של סיסטיק פיברוזיס.
- הבנת אינטראקציות אלו יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפול.
מטרת המחקר
- פיתוח מודל לבדיקת השפעות ההיפרוקסיה על מיקרוביום הריאות.
- שימוש במצע ליחה מלאכותי לגידול קהילות מיקרוביאליות.
- בחינת ההשלכות על סיסטיק פיברוזיס ומחלות ריאה כרוניות אחרות.
שיטות שהוצעו
- הכנה של מצע ליחה מלאכותי (ASCM).
- החדרה של תנאי חמצן משתנים באמצעות הזרקת גז (sparging).
- טיטרציית pH באמצעות בופר mops להשגת תנאים אופטימליים.
- סטריליזציה בסינון של המצע בסביבות מבוקרות.
תוצאות עיקריות
- מידול מוצלח של קהילות מיקרוביאליות בתנאי היפראוקסיה.
- הוכחת הסתגלות של מצע ליחה מלאכותי למחלות שונות.
- זיהוי אינטראקציות פוטנציאליות בין רמות גלוקוז לצמיחה מיקרוביאלית.
- אספקת מסגרת למחקרים עתידיים על מיקרוביומ של הריאות.
מסקנות
- המודל מדמה ביעילות את ההשפעה של חמצן תומך על מיקרוביומי ריאה.
- ניתן להתאים את מצע הליחה המלאכותי למצבים שונים של מחלות ריאה כרוניות.
- מחקר זה תורם להבנת הדינמיקה המיקרוביאלית בפיברוסיס קיסטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
מידול השפעת חמצן משלים על המיקרוביום של דרכי הנשימה בסיסטיק פיברוזיס נותן מענה לפער קריטי בהבנה כיצד תנאי היפראוקסיה משפיעים על הדינמיקה של הקהילה המיקרוביאלית. יכולת זו מאפשרת הערכה חיזוית של התערבויות טיפוליות ותומכת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בתהליכי גילוי תרופות למערכת הנשימה. גישה זו משפרת את הרצף התרגומי על ידי אספקת מערכת in vitro רלוונטית פיזיולוגית להסרה של סיכונים מכניסטיים ותיקוף מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תגובות קהילה מיקרובית למודולציה של חמצן במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת ההשפעות של היפראוקסיה (ריכוז חמצן גבוה) על אוכלוסיות של פתוגנים וקומונסלים.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות עבור התערבויות המיועדות למודולציה של מיקרוביוטת דרכי הנשימה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מצע ליחה מלאכותי סטנדרטי לתרבית מיקרובית הדירה תחת תנאי חמצן מבוקרים.
- מאפשר יצירת עקומות גדילה כמותיות עבור פתוגנים נפוצים של סיסטיק פיברוזיס באמצעות מדידות צפיפות אופטית.
- תומך במוכנות הבדיקה להערכת השפעות של תרכובות על הרכב המערכת המיקרוביאלית ועומס החיידקים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים בין ממצאים במבחנה (in vitro) לבין פרופילים קליניים של מיקרוביום דרכי הנשימה באמצעות השוואות של ריצוף מטגנומי.
- שומר על רלוונטיות תרגומית באמצעות שימור הגיוון וההרכב של הקהילה בתנאי נורמוקסיה והיפראוקסיה.
- מאפשר קידום מותאם-סיכון של טיפולים מווסתים של המיקרוביום, באמצעות מידול של חשיפה לחמצן משלים בעולם האמיתי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מערכת מודל זו משתלבת ברצף שבין הגילוי למחקר הפרה-קליני על ידי אפשור מחקרים מונחי-השערה לגבי השפעות החמצן על מיקרוביוטת דרכי הנשימה, ובכך היא תומכת הן בגילוי מוקדם והן במחקר תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות על שינויים מיקרוביאליים המונעים על ידי חמצן וההשלכות המכניסטיות שלהם.
- סקרינג: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור צמיחה מיקרוביאלית וניתוח קהילות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות של מטאגנומיקה וצפיפות אופטית להשוואות תנאים חסונות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין נתוני מיקרוביום in vitro לנתונים קליניים לצורך התאמה ותיקוף של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה גמישה הניתנת להתאמה למודלים אחרים של מחלות ריאה כרוניות ומצבים מטבוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בהתערבויות המכוונות למיקרוביום ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תנאי תרביות מיקרוביאליות ותומך בתהליכי עבודה ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשכה או הפסקה (go/no-go) עבור נכסים בפורטפוליו הנשמי על ידי מידול חשיפות לחמצן הרלוונטיות מבחינה קלינית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים למודולציה של המיקרוביום ותומך באינטגרציה של נתונים בין תוכניות שונות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות מיקרוביאליות, מטגנומיקה ומדלינג של מחלות נשימה.
- נדרשת גישה למערכות הזרקת גז מבוקרות, נקנעים עם מנער (incubator shakers) ותשתיות לרצף גנטי.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת מצע ליחה מלאכותי ולפרוטוקולים של ויסות חמצן.
- ניתן להתאים את השיטה למדלינג של מחלות ריאה כרוניות אחרות או תחלואים מטבוליים נלווים על ידי שינוי הרכב המצע.
- המגבלות כוללות את הצורך בניטור קפדני של החמצן וה-pH כדי לשמור על רלוונטיות פיזיולוגית.
