שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3
27 באוגוסט 2021
בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.
תצוגת פאג ' לא רק מסייעת לנו לחקור את המאפיינים המחייבים של אנזימים חשובים מבחינה קלינית, אלא גם לפתח אפננים לאותם אנזימים ולמחלות המתאימות. תצוגת Phage יכולה לשמש לפיתוח קלסרים חדשניים עבור מגוון רחב של חלבוני יעד והיא גם קלה יותר לביצוע מאשר שיטות תצוגה קונבנציונליות אחרות. הליך זה כלל הרבה פעולה חוזרת ונשנית, ולכן המפתח הוא לא טייס אוטומטי ולהישאר ממוקד לאורך כל הדרך.
התחל על ידי חנק 30 מיליליטר של ציר טטרציקלין 2YT עם 200 microliters של תרבות הזרעים. לדגור אותו במשך כשלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולי עד החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן. יש להשליך את תמסת הציפוי מהצלחת לכיור.
יבש אותו בעדינות עם מגבות נייר. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של חוצץ PB לכל באר מצופה. יש להשליך את חיץ ה-PB מהצלחת ולייבש אותו על מגבות נייר.
מוסיפים עוד 200 מיקרוליטרים של חוצץ PB לכל באר מצופה של הצלחת. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי. להפשיר את ספריית הפאג' על הקרח, ואז לדלל אותה לפי 100 מהמגוון בספרייה ב-PBS.
מוסיפים את תמיסת הנתרן כלורי פוליאתילן גליקול בחמישית מנפח הספרייה המדוללת ודגרים את הפתרון על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 11, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant צנטריפוגה אותו עוד שתי דקות כדי למשוך את supernatant הנותרים ולרכז את גלולה פאג '.
בעדינות resuspened את גלולה פאג במיליליטר אחד של חוצץ PBT לכל חלבון היעד להיות מנותח, בדרך כלל ארבעה בסך הכל. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ספריית פאג' לכל באר מצופה בלוח הבקרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
יש להשליך את חיץ ה-PB מצלחת היעד לכיור ולייבש את הצלחת על מגבות נייר. מעבירים את כל 100 המיקרו-לייטרים של ספריית הפאג' בלוח הבקרה לכל באר מצופה של לוחית המטרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
לאחר מכן, להסיר את ספריית פאג מהצלחת ולשטוף את הבארות מצופות ארבע פעמים עם חוצץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את טיפות החיץ האחרונות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית טוחנת 0.1 לכל באר מצופה כדי לחמוק מהפיג'.
לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם 300 סל"ד רעד מסלולי. לאחר מכן, לנטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של pH 11 טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת לכל באר מצופה. מעבירים את הפאג' הנבה מכל שמונה בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך פתרונות הומוגניים ושאיפה כל נוזל מן בארות. הוסף 10% BSA ל phage eluted כדי להפוך את הריכוז הסופי 1%לאחסן את צינור microcentrifuge בארבע מעלות צלזיוס. זהו הפלט העגול הראשון.
הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג ' לסיבוב הבחירה הבא על ידי חנק חמישה מיליליטרים של תרבות זרעי טטרציקלין 2YT עם מושבת E.coli מבודדת מצלחת אגר. לדגור אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. לדלל את חלבון היעד בסיבובים שניים ושלוש צינור עם כמות מתאימה של PBS.
יש ליטול מחצית מתכולת הסיבובים 2 ו-3 צינור ומצפה ארבע בארות לכל חלבון יעד בלוח כריכה של 96 בארות לסיבוב הבא. לאחר מכן, השתמש בחצי מהפלט העגול כדי לחסן שלושה מיליליטרים של תאי פאזה באמצע יומן הרישום. לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
הוסף M13KO7 עוזר פאג לריכוז סופי של 10 מיליארד PFU למיליליטר. לדגור אותו שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עם 200 סל"ד רעד מסלולי. לאחר שעה, להעביר את כל שלושת מיליליטר של תרבות ל 30 מיליליטר של פתרון 2YT carbenicillin kanamycin.
לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. התוצאות הייצוגיות לבחירה בגרסה בכל מקום מול UBE4B מוצגות כאן. UBVs הוזמנו מהתדירות הגבוהה ביותר לנמוכים ביותר.
רצפים מייצגים את אזור היוביקוויטין המגוון ב- UBV עם כל השאריות האקראיות. הזיקה המחייבת היחסית של הקלסרים לחלבון היעד של סוג הבר, חלבון היעד שעבר מוטציה, כמו גם חלבונים מחוץ למטרה נמדדת על ידי חיסון הקשור לאנזים או ELISA. כל ספיגות ELISA היו מנורמלות מול 96 ציוני BSA ELISA בממוצע ו 96 ציונים ממוצעים GST ELISA.
ירוק כהה יותר מייצג את הכריכה היחסית החזקה יותר. GST נכלל כפקד עבור כריכה לא מינית מכיוון שחלבון היעד מתויג GST. תוצאות ELISA מוצגות כאן באופן גרפי.
ציר ה- x מייצג את ה- UBVs וציר ה- y מייצג את הספיגה המנורמלת המתאימה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב כי אתה לא להשליך את הפתרון בצלחת לאחר הוספת חומצה הידרוכלורית. הפאג'ים מושעים כעת בפתרון וברצונך לשמור אותם כך שתוכלו לבצע ניתוחים אחרונים של העשרה או שניהם.
לאחר הליך זה, יש לבצע רצף כדי לקבוע תדרי UBV. ELISAs ובבדיקות IC50 ניתן לעשות כדי לקבוע יעילות מחייבת ויעילות מעכבות בהתאמה וגם כדי לעזור לקבוע אילו UBVs לאפיין עוד יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בתצוגת פאג'ים (phage display) לבידוד של וריאנטים חדשים של יוביקוויטין המסוגלים למשוף ליגזים E3 המעורבים בתהליך היוביקוויטינציה. יוביקוויטינציה היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית מכריעה הקשורה למחלות אנושיות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- הנדסת חלבונים
רקע
- יוביקיטינציה חיונית לוויסות פירוק חלבונים ותהליכים תאיים.
- שיבוש של תהליך היוביקיטינציה קשור למספר רב של מחלות.
- תצוגת פאג'ים (Phage display) היא טכניקה עוצמתית לגילוי אינטראקציות בין חלבונים.
- שיטה זו מאפשרת פיתוח של מודולטורים ספציפיים לאנזימים.
מטרת המחקר
- בידוד של וריאנטים חדשים של יוביקוויטין באמצעות תצוגת פאג'ים (phage display).
- הבנה של האופן שבו וריאנטים אלו עשויים להשפיע על פעילותם של ליגאזים מסוג E3.
- בחינת ההשלכות של מודולציה של יוביקוויטין בהקשרי מחלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקה של תרביות חיידקים במצע 2YT tetracycline broth.
- דגירה בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור אורביטלי.
- שימוש בטכניקות phage display לבדיקות קישור.
- בידוד ואפיון של וריאנטים של ubiquitin.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של וריאנטים חדשים של יוביקוויטין.
- הוכחת מאפייני קישור לליגאזות E3.
- פוטנציאל של וריאנטים אלו לווסת דפוסי יוביקוויטינציה.
- תובנות לגבי תפקידה של יוביקוויטינציה במנגנוני מחלה.
מסקנות
- תצוגת פאג'ים (Phage display) היא שיטה יעילה לגילוי וריאנטים של יוביקוויטין.
- לוויסות של פעילות E3 ligase עשוי להיות השלכות טיפוליות.
- דרוש מחקר נוסף כדי לבחון את היישומים הקליניים של ממצאים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הנדסה של וריאנטים של יוביקוויטין (UbVs) מונחית על ידי תצוגת פאג'ים (Phage display) מאפשרת ויסות מדויק של ליגאזים מסוג E3, המהווה נקודת מפנה קריטית לאישור יעדים במחקר של מערכת היוביקוויטין-פרוטאוזום. גישה זו מגבירה את רמת הביטחון החיזויית בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי יצירת קשרים ספציפיים בעלי זיקה גבוהה, המשמשים להפחתת סיכונים מכניסטיים ולבדיקה פונקציונלית של הביולוגיה של ליגאזים מסוג E3. ה-UbVs המתקבלים תומכים במיון ותיעדוף של תיקי פיתוח באמצעות אספקת כלים חסונים לפיתוח בדיקות המשך ומחקר תרגומי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה שיטתית של תפקוד E3 ligase באמצעות UbVs מהונדסים עם זיקה וספציפיות משופרות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד של וריאנטים המבחינים בין חלבונים מסוג פרא (wildtype) לבין חלבונים מוטגניים או חלבונים שאינם מטרה (off-target).
- מסייע בהגברת הביטחון החזוי במעורבות המטרה (target engagement) ובמחקרים מכניסטיים באמצעות סלקציה והעשרה איטרטיביות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק UbVs שעברו תיקוף לשימוש במבחני ELISA ו-IC50 לכימות קישור ויעילות עיכוב.
- מאפשר הערכה כמותית הדירה של אינטראקציות בין UbV למטרה לאורך סבבי ברירה מרובים.
- תומך בסטנדרטיזציה של המבחן ובמדרגיות עבור זרימות עבודה אמינות של הערכה וסריקה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה UbVs מהונדסים עם ליגזות E3 הרלוונטיות למחלה עבור מחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים, כאשר הדבר נתמך על ידי אפיון המשכי.
- שומרת על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אפשור פרופילינג פונקציונלי ומעכב נוסף של UbVs נבחרים.
- מפחיתה עמימות מכניסטית במודלים פרה-קליניים באמצעות אספקת כלים מולקולריים ספציפיים לחקירת מסלולים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פלטפורמת תצוגת הפאג'ים (phage display) זו משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת הן בבדיקת היפותזות והן בפיתוח מדידות כמותיות עבור מודולטורים של E3 ligase.
- ביולוגיה של גילוי: סלקציה והעשרה איטרטיביות מבהירות את מסלולי הקשירה של E3 ligase ומאמתות את המעורבות במטרה.
- סריקה: בדיקות ELISA ו-IC50 עם UbVs מספקות תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכה בהמשך התהליך.
- אנליטיקה: ריצוף ונורמליזציה של בליעה מאפשרים השוואה רהוטה של פרופילי קשירה של UbV ותדרי סלקציה.
- מחקר תרגומי: ניתן לקדם UbVs שאופיינו למחקרי המשך רלוונטיים למחלה, כפי שנתמך על ידי נתוני קשירה ועכבה.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה של תצוגת פאג'ים (phage display) ניתנת להתאמה עבור E3 ligases שונות ומטרות חלבון אחרות, ובכך תומכת ביכולת הרחבה של הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות של E3 ligase.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בחירת הקושרים ופיתוח הבדיקות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וקידום יעיל של משאבים עבור מטרות מתוקתקות.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעוד בעדיפות מותאמת סיכון וקידום של מודולטורים של E3 ligase בתוכניות גילוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ב-phage display, הנדסת חלבונים ובדיקות קישור כמותיות.
- מחייב גישה לתרביות חיידקים, טיפול בבקטריופאגים ומכשור ELISA.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ברירה, שטיפה ואנליזה.
- ניתן להתאמה לסוגי E3 ligases ולחלבונים מטרים שונים באמצעות עיצוב מתאים של הספרייה.
- תלוי בשטיפה וברירה קפדניות כדי למנוע העשרה של קושרים חלשים או לא ספציפיים.
