אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans
14 באוקטובר 2021
הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.
גישה פשוטה ננקטה כדי לעקוב אחר שינויים בפרוטאוסטזיס על ידי הערכת צבירת פוליגלוטמין ומתן מסגרת שיכולה לשמש ליישומי תפוקה גבוהה. ניקוד פנוטיפ כמו מספר הצברים על ידי אני יכול להיות סובייקטיבי. אוטומציה של ספירה מצטברת מאפשרת לנו לחסל הטיה כזו, להגדיל את התפוקה ואת יכולת השכפול.
שיטה זו מסייעת לזהות גנים חיידקיים התורמים לשיבוש הפרוטאוסטזיס של המארח. הבנת תרומתם של גנים חיידקיים בודדים תסייע לנו להבין את משמעותה בפתוגנזה של מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון והנטינגטון. התחילו בהסרת הצלחות המכילות תולעים מהמקפיא ותנו להן להפשיר בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן נגבו את העיבוי העודף והסירו את המכסה לפני ההדמיה. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ עם זמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה, הגדלה של 40 X עם מתאם מצלמה של 0.63 X ועוצמת GFP המוגדרת ל-100% במהלך לכידת התמונה. כעת התאימו את פקדי האור המועברים עד שהתולעים ייראו מוארות בבהירות בהשוואה לרקע הכהה, תוך הימנעות מחשיפת יתר.
שנה את מיקומי התולעים בתוך הבאר כדי למנוע גוש יתר על ידי שימוש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לדחוף בעדינות את התולעים לתנוחה הרצויה. הגדר את הערוץ למסנן GFP ליצירת מישור מוקד עבור שתי התמונות. צלם תמונת שדה בהיר.
צלם תמונה פלואורסצנטית מתאימה מבלי להפריע לצלחת, או לשנות את המיקוד של המיקרוסקופ. עכשיו כדי להעריך את התמונות, תחילה להוריד את CellProfiler. פתח את התוכנה, גרור ושחרר את התמונות המעניינות לתוך תיבת התמונות.
לחץ על התמונות ברשימת הקבצים כדי לפתוח אותן. בחר את זכוכית המגדלת כדי להדגיש אזור עניין ואת סמל החץ כדי למדוד את אורך התולעים והאגרגטים. רחף מעל האובייקט הרצוי כדי לקבוע את ערך העוצמה שלו, אותו ניתן לראות בחלק התחתון של המסך.
כדי להשתמש בצנרת ניתוח התמונות של CellProfiler, תן שם לצמדי התמונות כראוי כמתואר בכתב היד של הטקסט לאחר הורדת CellProfiler מהאתר הרשמי. הורד את הצינור והעלה אותו ל- CellProfiler על-ידי בחירת קובץ, ייבוא וצינור מהקובץ. בחר את מודול התולעים הלא סבוכות כדי לפתוח את ההגדרות שלו כדי לטעון ערכת אימון המשמשת לזיהוי תולעים במודול התולעים הלא סבוכות.
לאחר מכן זהה את שם הקובץ של ערכת האימונים. בחר את סמל קובץ ההעלאה והעלה גם את הקובץ המשלים. העלה תמונות על-ידי בחירת מודול התמונות בפינה השמאלית העליונה.
ולאחר מכן גרור ושחרר תמונות בעלות שם תקין. לפני ניתוח התמונות, בחר את תיקיית הפלט הרצויה שתשמש לאחסון התוצאות על ידי לחיצה על לחצן הגדרות הפלט הממוקם בסמוך לפינה השמאלית התחתונה של התוכנית. לאחר מכן בחר את סמל התיקיה מימין לפלט ברירת המחדל כדי לבחור את מיקום הפלט הרצוי.
בחר את סמל ניתוח התמונות כדי להתחיל בניתוח תמונות. אם הניתוח לוקח זמן רב מדי להשלים והוא תקוע בעיבוד תמונה בודדת, בטל את הריצה וזיהה את התמונה הלא מעובדת על ידי מיון בתיקיית הפלט, וציין איזה שם תמונה לא נמצא. לאחר ניתוח מלא, התוכנה תארגן את התוצאות לגיליון אלקטרוני של Excel המכיל תולעים בודדות בעמודה N, ואת מספר הצברים המתאים בעמודה K.הורד את מארגן המטא-נתונים כדי לארגן בנוחות נתונים מקובץ ה- CSV של הפלט מ- CellProfiler.
עבור מערכת ההפעלה Windows, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ אותו למיקום הרצוי. אתר ופתח את התיקיה שחולצה בשם gui_Windowsos_64x. והפעל את היישום על ידי לחיצה על סמל היישום GUI.
בקשה עשויה להיפתח ולבקש הרשאה לפעול. בחר מידע נוסף ולאחר מכן לחץ על הפעל בכל מקרה. מארגן המטא-נתונים מוכן כעת לגרור ולשחרר קבצי CSV של פלט CellProfiler.
עבור Mac OS, אתר את הקובץ שהורדת וחלץ את קובץ היישום של מערך המטא-נתונים של הקובץ. פתח את התיקיה שחולצה ונמצאה בהורדות. לחץ לחיצה ימנית על יישום ממשק המשתמש הגרפי ובחר פתח.
תופיע הנחיה המבקשת רשות לפתוח בשל היעדר רישיון רשמי. בחר פתח. לאחר שיישום מארגן המטא-נתונים שלך פתוח במערכת ההפעלה המתאימה, לחץ על העלה את הקבצים שלך לכאן, או גרור ושחרר את קבצי ה- CSV הרצויים של CellProfiler.
לחץ על כפתור הארגון, שיביא את המשתמש למסך חדש עם כפתור הורדת קבצים. לחץ על הלחצן ובחר את המיקום הרצוי כדי לשמור את קובץ הפלט. קובץ הפלט יופיע כשם הקובץ המקורי עם סיומת _organized שנוספה לשם הקובץ.
בנוכחות FUDR, לתולעים שניזונו מחיידקים שונים היה גודל גוף עקבי יותר שאיפשר זיהוי תולעים אחיד ומדויק יותר, ובכך פתר את בעיית הצפיפות. הקפאת התולעים שיפרה את זיהוי הצבירה של PolyQ על ידי ביטול הפלואורסצנציה ברקע, כמו גם הדיוק של ספירה אוטומטית הדומה לספירה ידנית. תאורת שדה בהיר הפוכה שימשה לזיהוי כל C.elegans וערוץ GFP כדי לצלם אגרגטים של polyQ YFP.
זיהוי תולעים, התרת סבך וכימות צבירה עבור כל תולעת נעשו על ידי החלת צינור עיבוד תמונה מותאם CellProfiler, המאפשר קבלת מספר האגרגטים לכל תולעת בודדת. ההבדל בין היעילות של כימות צבירה אוטומטי לבין שימוש בצנרת CellProfiler היה מזערי, מה שמצביע על כך שניתן ליישם את השיטה האוטומטית על מסכים בקנה מידה גדול. מתוך 90 זני חיידקים שנבדקו, התיישבות במעי C.elegans עם מועמד אחד הראתה ירידה משמעותית במספר הצברים.
ניסויי האישור על ידי ספירה ידנית גילו שאף אחד מהמוטאנטים, כולל זה שהפחית באופן משמעותי את מספר האגרגטים, לא השפיע על צבירת ה-polyQ. חוקרים המחליטים להשתמש במסגרת זו צריכים להבין שהצעדים המתוארים אינם מוחלטים. שינוי והבנה בסיסית של כיצד לתמרן את CellProfiler חיוניים להצלחה.
ניתן להשתמש בגישות ביוכימיות נוספות כגון כתם מערבי כדי לאשר צבירה של polyQ.
סקירה כללית
מחקר זה מפתח תהליך עבודה בתפוקה גבוהה לתרבית תולעים, דימות פלואורסצנטי ועיבוד תמונה אוטומטי לצורך כימות צברי פוליגלוטמין כמדד לשינויים בסיסטזיס של חלבונים (proteostasis). השיטה משפרת את הערכת הצברים הללו, במיוחד בבחינת תפקידם במחלות ניוורו-דגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המחקר
- פרוטאוסטזיס
- מחלות ניווניות של מערכת העצבים
- סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה
רקע
- אגרגציה של פוליגלוטמין מקושרת למחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון והנטינגטון.
- הבנת התרומה של גנים בבקטריות להפרעה ב-proteostasis היא חיונית.
- שיטות דירוג מסורתיות לאגרגטים עשויות להיות סובייקטיביות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי וניתוח בתפוקה גבוהה באמצעות CellProfiler
- C. elegans כמודל ביולוגי
- כימות אוטומטי של אגרגטים של פוליגלוטמין
תוצאות עיקריות
- עיבוד תמונה אוטומטי מאפשר ביטול הטיות והגברת השחזוריות בספירת צבירים.
- זוהו גנים בקטריאליים המשפיעים על הפרוטאוסטזיס (proteostasis) של המארח, עם ממצאים משמעותיים במספר צבירי התולעים.
- תוצאות מאומתות מעידות כי האוטומציה דומה לספירה ידנית, דבר התומך בסריקות רחבות היקף.
מסקנות
- מחקר זה מספק מסגרת מהימנה לבדיקת פרוטאוסטזיס באמצעות אגרגציה של פוליגלוטמין.
- התובנות שהתקבלו משיטה זו רלוונטיות להבנת מנגנונים במחלות נוירודגנרטיביות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אוטומציה של כימות אגרגטים ב-C. elegans נותנת מענה לצורך בהערכה של פרוטאוסטזיס במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות, באופן בעל תפוקה גבוהה וללא הטיות. באמצעות סטנדרטיזציה של רכישת תמונות וניתוח מבוסס CellProfiler, השיטה מאפשרת סריקה הדירה של ספריות תרכובות או ספריות גנטיות גדולות. הדבר תומך בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים (de-risking) במסלולי גילוי למחלות של קיפול חלבונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של אגרגציה של פוליגלוטמין כמדד להפרעה בפרוטאוסטזיס.
- ערך תפעולי: מפחית סובייקטיביות בניקוד פנוטיפי, ובכך משפר את מהימנות הנתונים עבור קמפיינים של תיקוף מטרות.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור לצורך תיעדוף תרכובות מבוסס מנגנון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר ספירות צביריות כמותיות וסטנדרטיות לכל תולעת, המאפשרות תוצאות בדיקה אמינות עבור קמפיינים של סינון.
- ערך תפעולי: מגדיל את התפוקה ואת השחזוריות באמצעות אוטומציה, ובכך מפחית את העבודה הידנית ואת השונות בין המפעילים.
- מוכנות הבדיקה: מפיק פלט מובנה (גיליון Excel עם ספירות תולעת וצבירים) התואם לתהליכי ניתוח נתונים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מודלים של פרוטאוסטזיס ב-C. elegans למנגנונים של מחלות נוירודגנרטיביות בבני אדם באמצעות נתיבים שמורים של אגרגציה של polyQ.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מסייע בזיהוי של משנים (modifiers) בקטריאליים או גנטיים של האגרגציה, ובכך תומך בתיקוף של מטרות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביטחון חיזוי: מאפשר לצוותים רב-תחומיים להשוות תנאים באמצעות כימות אוטומטי ונורמליזציוני של האגרגטים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים כמותיים של הומאוסטזיס חלבוני המנחים החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go).
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת השערות על מנגנוני פרוטאוסטזיס על ידי מתן אפשרות לפנוטיפינג אובייקטיבי ובעל תוכן גבוה של אגרגציה.
- סריקה: מספקת דימות ואנליזה סטנדרטיים של תולעים, המוכנים לבדיקה ותואמים לסריקות בפורמט של 96 בארות או פורמטים גדולים יותר.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (אגרגטים לתולעת) המאפשרות השוואה סטטיסטית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים ממודלים של חסרי חוליות למסלולי מחלות אנושיות באמצעות ביולוגיה של אגרגציה שמורה.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: מבססת תהליך דימות ואנליזה לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למספר יעדי פרוטאוסטזיס ולקמפיינים של סריקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי ביטול הטיות הנובעות מספירה ידנית של אגרגטים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות עיבוד תמונה סטנדרטי ופלט נתונים אוטומטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לביצוע סריקות רחבות היקף עם הפחתה בזמן העבודה הידנית ואיכות נתונים גבוהה יותר.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות ביומרקרים כמותיים ומהימנים של פרוטאוסטזיס.
שיקולי יישום
- דורש היכרות עם מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ופרמטרי דימוי GFP/YFP לזיהוי polyQ.
- תלוי בתוכנת CellProfiler ובהגדרות ה-pipeline הנלוות לסגמנטציה אוטומטית של תולעים ואגרגטים.
- מחייב שמות תמונות סטנדרטיים וארגון תיקיות לצורך עיבוד אצוות (batch processing) מוצלח.
- מומלץ להשתמש בטיפול FUDR כדי להפחית את השונות בגודל התולעים ולשפר את דיוק הזיהוי בבארות בעלות צפיפות גבוהה.
- מסתמך על הכשרת המשתמש לצורך התאמת ה-pipeline לזנים שונים של תולעים, דפוסי ביטוי או מערכי דימוי שונים.
