דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימים רציפים

שיטה זו מאפשרת לייצר דפוסים מוגדרים על ידי המשתמש של מיקרואורגניזמים בתוך ערוץ מיקרופלואידי. לאחר דפוס, מיקרואורגניזמים ניתן לפקח כדי להעריך את הפיזיולוגיה ארוכת הטווח שלהם אינטראקציה עם תפוקה גבוהה. השימוש בכוחות נימיים מאפשר מסלול לא ספציפי לדפוסי דפוס, אשר ישים על פני סוגים שונים של חומרים.

לדוגמה, חלקיקים קולואידיים וחיידקים. יתר על כן, הוא מאפשר לייצר מערכים גדולים עם שליטה מעולה של הסידור המרחבי של החומר מעניין. עד כה, בדקנו ויישמנו את השיטה על חלקיקים קולואידיים ותאי מיקרוביאלית.

כתוצאה מכך, הוא יכול למצוא יישומים בהנדסת חומרים ותחומים הדורשים ניתוח כמותי של תא יחיד כמו הקרנת סמים. כדי להתחיל, להכין תערובת PDMS על ידי ערבוב elastomer עם סוכן cross-linking שלה. לאחר מכן מערבבים את התערובת במרץ כדי למזג את שני הרכיבים באופן אחיד עד שנוצרות בועות אוויר ותערובת PDMS נראית אטומה.

עכשיו, degas את התערובת במייבש ואקום עד שכל בועות האוויר מוסרות והתערובת נראית שקופה שוב. כדי להשיג רצפת תבנית בעובי 400 מיקרומטר של השבב המיקרופלואידי, יוצקים שלושה גרם מהתערובת על מאסטר הסיליקון ומניחים את מאסטר הסיליקון על מעיל ספין כדי לסובב את המעיל ב 21 פעמים G במשך חמש שניות ו 54 פעמים G במשך 10 שניות. דגה שוב להסרת בועות האוויר הלכודות כפי שתואר קודם לכן.

יוצקים 20 גרם של תערובת PDMS לתוך התבנית המודפסת 3D כדי להפוך את המיקרו-ערוצים אשר ישמש כגג של שבב microfluidic ו degas אותו במשך 30 דקות כפי שתואר קודם לכן. אופים את רקיק הסיליקון ואת התבנית המודפסת בתלת-ממד ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, ואז חותכים את ה-PDMS לאורך קווי המתאר של התבנית המודפסת התלת-ממדית ומקלפים אותה. חותכים את ה- PDMS עם להב סביב המיקרוצ'אנלים ומנקבים את החורים שישמשו ככניסה ושקע של הערוץ המיקרופלואידי.

עכשיו לחתוך את PDMS ולקלף אותו מאסטר סיליקון לחתוך את שכבת PDMS לחתיכות קטנות יותר עם אותם ממדים של ערוצי microfluidic כי יהיה מלוכד על גבי התבניות. יש לשפשף בעדינות את התבניות והמיקרו-צ'אנלים באמצעות תמיסת חומר ניקוי של 1% למשך חמש דקות ולאחר מכן לשטוף במים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, לשטוף את התבניות microchannels עם איזופרופנול, לפני שטיפה אותם עם מים deionized.

עכשיו יבש את התבניות ואת microchannels בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת עם אוויר דחוס בבר אחד. מקם את התבניות ואת microchannels בניקוי פלזמה עם משטחי מליטה פונה כלפי מעלה. לאחר הפעלת מנקה הפלזמה, פלזמה לטפל בתבניות microchannels במשך 40 שניות, ולאחר מכן להוציא אותם מן מנקה הפלזמה ומיד לקשר את microchannels על גבי התבניות.

יש לאחסן את השבבים המיקרופלואידיים בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים כדי להבטיח התאוששות הידרופובית של PDMS. ביום הניסוי, להגדיר את אינקובטור התיבה ב 37 מעלות צלזיוס כמה שעות לפני הניסוי, ולאחר מכן להגדיר את משאבת המזרק ואת צלחת הזכוכית המחוממת על במת המיקרוסקופ, קביעת אותה טמפרטורה כמו של אינקובטור התיבה. 90 דקות לפני הניסוי, לשים את שבב microfluidic בכלי מלא 100% אתנול ולשטוף את הערוץ עם 100% אתנול במשך 10 דקות לפחות, ולאחר מכן למקם את השבב microfluidic במייבש ואקום degas במשך 30 דקות לפחות.

עכשיו להחליף את האתנול עם מים מזוקקים ואקום לטפל השבב במשך 30 דקות לפחות. שים את שבב microfluidic בתנור ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר את כל עקבות של נוזל שנותר בתעלה. פיפטה מיליליטר אחד של MOPS בינוני לתוך בקבוקון צנטריפוגות ולהוסיף 10 מיקרוליטר של 0.132 טוחן אשלגן פוספט.

Aliquot 100 מיקרוליטרים של תרבות הלילה לתוך בקבוקון צנטריפוגות וצנטריפוגות התרבות ב 2, 300 פעמים G במשך שתי דקות. להשליך בעדינות את supernatant כדי resuspend את הכדור במיליליטר אחד של מדיום MOPS טרי עם 0.015% של Tween 20 ו 0.01% של אשלגן פוספט לטעון את ההשעיה חיידקית במזרק מיליליטר אחד. כדי לאבטח את המזרק ואת חיבור הצינורות, הכנס ישירות מחט לתוך הצינורות.

עכשיו להרכיב את המזרק על משאבת המזרק ולהזריק את ההשעיה לתוך שבב microfluidic דרך הכניסה הממוקמת בחלק במעלה הזרם של הערוץ עד ההשעיה מכסה את אזור התבנית עם מלכודות. הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של 0.07 עד 0.2 מיקרוליטרים לדקה כדי למשוך את ההשעיה החיידקית ולנטר את תהליך הדפוס באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. לאחר שהתבנית עוצבה עם תאים, הגדל את קצב זרימת הנסיגה כדי לרוקן במהירות את הערוץ המיקרופלואידי ולשטוף אותו עם LB טרי שהיה בעבר degassed במשך לפחות 30 דקות ונחרם מראש ב 30 מעלות צלזיוס.

כעת הגדר את משאבת המזרק בקצב זרימה של שני מיקרוליטרים לדקה כדי לשטוף בעדינות את הערוץ. לאחר מילוי הערוץ, הגדל שוב את קצב הזרימה. לרכוש תמונות של חיידקים גדלים בהגדלה הרצויה ומרווח הזמן.

פיפטה 900 מיקרוליטרים של 0.015%Tween 20 פתרון מימי לתוך בקבוקון צנטריפוגות ולאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטרים של ההשעיה הקולואידית המקורית לתוכו. צנטריפוגה ההשעיה ב 13, 500 פעמים G במשך דקה אחת בעדינות להחליף את supernatant עם פתרון Tween 20 מימית. טען את ההשעיה הקולואידית במזרק מיליליטר אחד וחבר את המזרק לשבב באמצעות צינורות מיקרופלואידיים.

הזרק את המתלה לתוך שבב microfluidic דרך הכניסה הממוקמת בתוך החלק המרכזי בחלק במעלה הזרם של הערוץ ולדחוף בהדרגה את המתלה עד התבנית מכוסה. הסר את ההשעיה הקולואידית בקצב זרימה של 0.07 עד 0.2 מיקרוליטרים לדקה ודמיין את תהליך התבנית באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. הגדל את קצב הזרימה ברגע שהמניסקוס מגיע לסוף התבנית במהירות.

גיאומטריית הערוץ הישר נוצלה לתבנית תאים נייחים בשלבים של זן קולי Escherichia פלואורסצנטי הפקדת 83% מתוך 5, 000 מלכודות מנותחות. חיידקים בדוגמת חידשו את הצמיחה בזמנים שונים בתוך 1.5 שעות מרגע שהערוץ היה מלא ב- LB טרי. לאחר חידוש הצמיחה, תאי חיידקים בודדים החלו ליצור מושבות בודדות שהתרחבו עד שנוצרה שכבת שטח ורזולוציית התא הבודד אבדה. ניתוח שנערך מעל 55,000 מלכודות הראה כי דימרים ירוקים-אדומים שנעשו על ידי שני חלקיקים בקוטר מיקרומטר אחד נוצרו ב -93% ו -89% מהמלכודות המנותחות בהתאמה.

וגוזמים ירוקים-אדומים-ירוקים נוצרו ב-52% מהמלכודות. המרחק בין חלקיקים בדוגמת יכול להיות נשלט במדויק על ידי ביצוע שני תצהירים בכיוונים מנוגדים, ובכך ללכוד חלקיקים כאלה בקצוות הנגדיים של כל מלכודת. חשוב להבטיח טמפרטורה אחידה על פני התבנית כדי למנוע עיבוי במהלך תהליך התבנית.

לשם כך, אנו מניחים צלחת זכוכית מחוממת מתחת לתבנית ומגדירים אותה באותה טמפרטורה כמו אינקובטור הקופסה. שיטה זו יכולה לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים הכוללים ניתוח כמותי של תא יחיד. יתרון ייחודי הוא כי טבע התפוקה הגבוהה שלה המאפשר דפוס של אלפי תאים המספקים סטטיסטיקה גדולה באותה זירה ניסיונית.