בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

פרוטוקול זה חשוב מכיוון שהוא מספק דרך לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות ממגוון חיידקים באופן הניתן לשחזור רב. היתרון הגדול בטכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבודד כלי רכב חשמליים מסביבות גדולות למדי של תרביות חיידקים, מה שיאפשר מחקרי in vivo. בעוד שהנתונים שאנו מראים משקפים יישומים פרה-קליניים, ניתן לצפות כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור כלי רכב חשמליים חיידקיים לטיפולים.

שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת תרבית תאים מדרגית עם שינוי קל. בגלל מדרגיות הפרוטוקול, חשוב שיהיו מסננים בגודל מתאים ועמודות SEC כדי לטפל בנפחים ההתחלתיים הרצויים של תרבית תאי חיידקים. המדגימים את הנהלים הם סיידי ג'ונסון, עוזר טכנולוג במעבדתו של ד"ר ג'סטין לתיה, דיוניסיוס ווטסון, עמית אונקולוגי במעבדתו של ד"ר ג'סטין לתיה, ואקים סנטוס, טכנולוג מחקר במעבדה שלי.

התחל על ידי חיסון מושבות בודדות של Escherichia coli לתוך 250 עד 1000 מיליליטר של לוריא-ברטני, או מרק LB, באמצעות לולאה סטרילית. לאחר מכן, דגרו את התרבית באופן אירובי באינקובטור רועד ב-300 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות של דגירה, להבהיר את מדיום תרבית החיידקים על ידי העברת תרביות התאים לניקוי בקבוקי צנטריפוגה פוליפרופילן 500 מיליליטר לצנטריפוגה ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה בארבע מעלות צלזיוס ו -5, 000 פעמים G למשך 15 דקות.

העבר את הסופרנטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה בזהירות לצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, העבר את ה- supernatant להתקן מסנן מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל 0.2 מיקרון בגודל המתאים וחבר את התקן הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד באופן משמעותי, העבר את החומר הלא מסונן למכשיר חדש.

ניתן לאחסן את המדיום המסונן בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה או לעבד אותו באופן מיידי. כדי לבדוק את ההסרה המלאה של התאים בני הקיימא, פזרו אליקוט של הסופר-נאטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות וודאו היעדר מושבות לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. לריכוז המדיום המסונן בנפח של 100 מיליליטר, טען 90 מיליליטר של מדיום תרבות מסונן על המאגר של מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון וצנטריפוגה של המדיום ברוטור דלי מתנדנד בארבע מעלות צלזיוס ו -2, 000 פעמים G במרווחים של 15 עד 30 דקות עד שנפח המאגר העליון התרכז לפחות מ -0.5 מיליליטר.

כדי למלא את המאגר בכל אמצעי תרבות מסונן שנותר, הסר את הזרימה בתחתית המכשיר כדי לאזן מחדש. אם הצמיגות של המדיום המרוכז במאגר גדלה באופן ניכר, דלל את המדיום עם PBS ו reconcentrate על ידי צנטריפוגה כדי להפחית כל שלפוחית שאינה חוץ-תאית, או חלבוני EV, קטן יותר מאשר חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון. לאחר מכן, העבר את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לרכז את המדיום המסונן בנפח גדול מ-100 מיליליטר, בחר סינון זרימה משיק בגודל מתאים, או התקן TFF, עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילו-דלטון.

לאחר הרכבת מעגל סינון כפי שמוסבר בכתב היד, לשאוב 200 מיליליטר של PBS לתוך כלי מדורג כדי לקבוע את המהירות המתאימה המתאימה לקצב הזרימה הרצוי. כאשר המהירות מוגדרת, מפיצים את המדיום המותנה המסונן בכ-200 מיליליטר לדקה בטמפרטורת החדר ואוספים את המולקולות הקטנות מ-100 קילו-דלטון, תוך חציית קרום האולטרה-סינון כפסולת בכלי נפרד עד שנפח המדיום המותנה הופחת ל-100 עד 200 מיליליטר. ברצף לדלל את הנפח המסונן פי שניים עם PBS ולהמשיך להפיץ את המדיום עם המשאבה בכלי קטנים יותר כדי לרכז את הנפח ל 75 עד 100 מיליליטר, ולאחר מכן ל 25 מיליליטר ו 10 מיליליטר.

הרם את צינורות ההזנה ממאגר הדגימה ושאב כדי לטהר את המסנן כדי לשחזר את הכמות המרבית של הדגימה. העבר את הדגימה המרוכזת למכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי של 15 מיליליטר עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד בארבע מעלות צלזיוס ו -2, 000 פעמים G למרווחים של 15 עד 30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון הוא פחות משני מיליליטר. העבירו את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון לאחסון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לבידוד של כלי הרכב החשמליים, בצע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, או SEC, באמצעות עמודה קטנה עם נפח מיטה של 10 מיליליטר עבור פחות מ-100 מיליליטר של חומר מוצא ועמודה גדולה יותר עם נפח מיטה של 47 מיליליטר עבור יותר מ-100 מיליליטר של חומר מוצא. במשך מספר שעות לפני הניסוי, הביאו את עמודת ה-SEC וה-PBS לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ייצוב העמודה במצב אנכי באמצעות מעמד ומחזיק מעבדה סטנדרטיים. לפני שתתחבר לעמודת ה- SEC, הלח את מאגר הדגימה על ידי מתן אפשרות לחמישה מיליליטרים של PBS לזרום דרך הפריט למיכל פסולת.

לאחר מכן, פתח את מכסה הכניסה של העמודה כדי להוסיף שני מיליליטר של PBS למאגר הדגימה וחבר בזהירות את המאגר לעמודה כאשר ה- PBS מטפטף החוצה דרך הפריט. לשיווי משקל של העמודה, הוסף 47 מיליליטר של PBS למאגר הדגימה, ולאחר מכן פתח את החלק התחתון של עמודת ה- SEC. לאחר מכן, אפשר לכל מאגר הדגימה שנטען לזרום דרך העמודה ולהשליך את הזרימה.

לאחר טעינת שני מיליליטר של הדגימה על מאגר הדגימה, אפשרו לדגימה להיכנס לעמודה במלואה ולאסוף את הזרימה. הוסף מיד PBS למאגר הדגימה בנפח של 14.25 מיליליטר פחות נפח הדגימה כדי לאפשר לתמיסה לזרום דרך העמודה, תוך השמטת הכמות השווה לנפח ריק העמודה. לאחר מכן, מקם מיקרו-צינורית בעלת קשירה נמוכה של שני מיליליטר ישירות מתחת לעמודת ה-SEC כדי לאסוף את הזרימה הראשונה או את השבריר הראשון לאחר שאפשרה לשני מיליליטרים של PBS לעבור דרך העמודה.

המשך להוסיף שני מיליליטר של PBS למאגר הדגימה כדי לאסוף כל שבר עוקב. אחסן את השברים שנאספו בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לבדיקת סטריליות של השברים שנאספו של כלי רכב חשמליים, יש לחסן שלושה מיליליטרים של מדיום התרבית עם 100 מיקרוליטרים של השברים שישמשו במבחנים.

לאחר מכן, תרבו את המדיום בתנאים אופטימליים תוך התבוננות בעכירות במשך שלושה ימים לפחות. לחלופין, ניתן ליישם את דגימות השבר על צלחות אגר המכילות את המדיום המשמש לגידול החיידקים המייצרים, ולאחר מכן לבדוק אם נוצרו מושבות. לאחר מכן, אחסנו את כלי הרכב החשמליים על ידי העברת 25% עד 50% מהשברים הבודדים או המאוגדים לצינורות קשירה דלי חלבון במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הפשרה בהקפאה.

הניתוח הייצוגי מראה את ההעתקה של רכבים חשמליים מסוג Escherichia coli MP1 בשברים המוקדמים של הכרומטוגרפיה. השברים 1 עד 6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים, עם קוטר ממוצע נמוך מ-100 ננומטר. יחד עם זאת, השברים הבאים הכילו חלבונים נטולי EV ומעט מאוד כלי רכב חשמליים.

העשרת EV וגודלו אושרו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, במיוחד בשברים שניים עד שישה. נצפה כי שברים מועשרים ב-EV שניים עד שבעה היו בעלי פעילות ננו-לוציפראז גבוהה, אך רק אות פלואורסצנטי נמוך מאוד מ-mCherry שאינו קשור ל-EV בהשוואה לזה של השברים המאוחרים יותר. תיוג האימונוגולד אישר את הקשר EV של ננולוציפראז בשברים שניים עד חמישה.

תחולת הפרוטוקול על מיני החיידקים האחרים הוערכה על ידי בידוד כלי רכב חשמליים מתרביות של חיידקים אנאירוביים מגוונים. נצפה כי שברי הכרומטוגרפיה המוקדמים 1 עד 4 היו מועשרים עבור כלי רכב חשמליים, עם קוטר נמוך מ -100 ננומטר. עירוי המוח-לב המורכב, או BHI, הכיל את החלקיקים בגודל EV בפחות מ-25% מתפוקת הרכב החשמלי הכוללת.

חשוב להשתמש במכשירי TFF המסוגלים להתמודד עם הנפח ההתחלתי של תרבית תאי החיידקים. טכניקה זו מאפשרת לנו לייצר מספיק כלי רכב חשמליים כדי לשאול שאלות ביולוגיות על תפקודם במודלים מורכבים של בעלי חיים.