שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר
30 בנובמבר 2021
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.
פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה של שינוי גנטי במבחנה למחקר המולקולרי של מסלול האיתות התלוי בסיליום העיקרי בתרבויות המבשרות העיקריות של תאי הגרגיר. בשל העלות, הכדאיות הנמוכה והיעילות הלקויה של שיטת הטרנספקטיה הנוכחית, אנו מציגים טכניקת אלקטרופורציה פשוטה, חסכונית ויעילה לחקירת מסלול איתות תלוי טיליום בתרבויות GCP ראשוניות. כדי להתחיל, להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבות לתוך כל באר של צלחת התרבות 24-well המכילה תלושי כיסוי מצופים, ולשמור אותו חם ב 37 מעלות צלזיוס בחממה דו תחמוצת הפחמן.
פיפטה את המספר הנדרש של תאים לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge ולהסתובב ב 200x G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השלך את supernatant ו resuspend את גלולה התא ב 200 מיקרוליטרים של Opti-MEM. חזור על הליך זה פעמיים כדי להבטיח שאין מדיום תרבות שיורית נמצא בצינור.
הגדר את הפרמטרים של אלקטרופורציה כמפורט. פיפטה תגובת electroporation בעדינות לערבב היטב, ולהשתמש קצה פיפטה P200 ארוך כדי להעביר נפח מדויק של 100 מיקרוליטר של התערובת לתוך קובט פער שני מילימטר. ברגע שהקובט נמצא בתוך תא הקובט, לחץ על כפתור האומגה של האלקטרופורטור ושים לב לערך העכבה על ידי היצמדות לנפח מדויק של 100 מיקרוליטרים.
טווח ערך העכבה צריך להיות כ 30 ו 35. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את הדופק. הקלט את הערכים הנוכחיים הנמדדים ב- Joules המוצגים במסגרת הקריאה.
הסר את הקובט מהתא. מיד להוסיף 100 microliters של מדיום תרבות שחומם מראש לתוך cuvette ו resuspended אותו על ידי צנרת למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים. העבר מיד את ההשעיה התאית ללוחית 24 הבאר שהוכנה בעבר.
לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממה דו תחמוצת הפחמן. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות למחרת. במחקר הנוכחי, יעילות האלקטרופורציה של קבוצות שטופלו ב- DMSO ו- SAG נראתה דומה.
חיסון של סמן הסיליום הראשי Arl13b מדגים כי שיעור ההשתייכות של GCP בדיו-2 של התרבות הן ברכב והן בקבוצות שטופלו ב- SAG. שיעור ההשתייכות ממחיש את אחוז ה-Pax6 המבטאים GCPs הנושאים סיליום ראשי על פני התא ב-div-2 לאחר אלקטרופורציה. האיור מראה עלייה משמעותית בלוקליזציה EGFP מוחלקת על cilium axoneme העיקרי של Px6 ביטוי GCP תאים ב 24 שעות לאחר טיפול SAG, המציין הפעלה עמוקה של מסלול איתות קיפוד תלוי cilium העיקרי.
על מנת להשיג יעילות אלקטרופורציה גבוהה יותר, יש להבטיח טוהר גבוה של הפלסמיד המשמש, ואין מדיה תרבית שאריות נמצא בתערובת אלקטרופורציה פלסמיד. פרוטוקול זה צריך להיות ישים ישירות ומועיל לניסויים בשינוי גנטי במבחנה על תרבויות ראשוניות וסוגי תאים שקשה להעביר, כולל נוירונים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה in vitro הניתן לשחזור, שנועד למניפולציה גנטית של תאי אב (precursors) של תאי גרנולות של ה cerebellum הראשוניים (GCPs). הוא מתמקד בשיטה שהיא גם יעילה וגם חסכונית לחקר מסלולי השמירה של Hedgehog התלויים ברישום הראשוני (primary cilium).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מניפולציה גנטית
- אותיות תאיות
רקע
- תאי קדם של תאי גרנולר במוח הקטן (GCPs) הם קריטיים לחקר התפתחות עצבית.
- שיטות טרנספקציה נוכחיות הן לרוב לא יעילות ויקרות.
- הריס הראשוני חיוני למסלולי העברה שונים, כולל שורת האיתות של Hedgehog.
- אלקטרופורציה מציעה פתרון פוטנציאלי לאתגרים אלו.
מטרת המחקר
- להצגת טכניקת אלקטרופורציה יעילה עבור תרביות של GCP.
- להקל על חקר סיגנלינג התלוי בשריש ראשוני (primary cilium).
- לשיפור תוצאות המניפולציה הגנטית בסוגי תאים שקשה להעביר להם טרנספקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הניסוי השתמש בתרביות in vitro של GCPs ראשוניים.
- פרוטוקול האלקטרופורציה כלל פרמטרים ספציפיים לצורך מודיפיקציה גנטית יעילה.
- במחקר לא הוזכרה גישה מולטי-אומיקית (multiomics).
- שלבים קריטיים כללו את רסספנסיית התאים ואת רצף האלקטרופורציה.
- צביעה אימונוהיסטוכימית שימשה להערכת שיעורי הציליאציה והפעלה של מסלולי איתות.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול הדגים עלייה משמעותית בהפעלה של מסלול השמעת האותות Hedgehog ב-GCPs שעברו טיפול.
- צביעה אימונולוגית חשפה עלייה ניכרת בשיעור הציליציה ב-GCPs לאחר אלקטרופורציה.
- המחקר סיפק תובנות לגבי היעילות של אלקטרופורציה בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- המחקר הסיק כי טיהור גבוה של הפלסמיד הוא קריטי להצלחת האלקטרופורציה.
מסקנות
- מחקר זה מציג פרוטוקול בעל ערך למניפולציה גנטית בתאי GCP ראשוניים.
- הממצאים משפרים את ההבנה של מנגנוני סיגנלינג התלויים בשעירה הראשונית (primary cilium).
- יישומים עתידיים עשויים לכלול סוגי תאים שונים שקשה לבצע להם טרנספקציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מניפולציה גנטית יעילה של תאי קדם של תאי גרנולות ראשוניים (GCPs) חיונית להבנת מנגנוני סיגנלינג תלויי-ריסון (cilium-dependent) העומדים בבסיס נתיבים של התפתחות נוירולוגית ומחלות. פרוטוקול אלקטרופורציה זה מספק יעילות טרנספקציה גבוהה וחיוניות תאים, המאפשרים חקירה רחבה של דינמיקת נתיב Hedgehog במערכות הרלוונטיות למחלות. השיטה תומכת בביטחון ניבויי בשלבי גילוי מוקדמים ובתיקוף מטרות עבור מודולטורים של נתיבי סיגנלינג.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה גנטית פונקציונלית של סיגנלינג Hedgehog התלוי בשעירה (cilium) בתאי GCP ראשוניים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של מיקום מרכיבי המסלול.
- מסייע באימות מטרות באמצעות מניפולציה הניתנת לשחזור של צמתי סיגנלינג בתאים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות תאים ראשוניות שעברו וולידציה לסריקה המשכית של משפיעי מסלולים (pathway modulators).
- מספק יעילות טרנספקציה גבוהה (~80-90%) וחזרתיות עבור תוצרי בדיקה כמותיים.
- מאפשר פיתוח בדיקות בר-הרחבה וכלכלית עבור מודלים נוירונליים שקשה לבצע להם טרנספקציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים in vitro לבין פנוטיפים תאיים הרלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- תומך בגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי מתן אפשרות למעקב דינמי אחר מיקום של חלבוני איתות.
- מפחית סיכון ביולוגי בשלב הפיתוח הפרה-קליני באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים חזקים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בשלבים המוקדמים של הגילוי ותיקוף המטרה, ומגשר בין מניפולציה גנטית לניתוח כמותי של מסלולים במערכות נוירונליות ראשוניות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרה של מסלולים בתאי GCP ראשוניים.
- סריקה: מספקת טרנספקציה יעילה וניתנת לשחזור עבור מוכנות לבדיקה ותוצאות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של שיעורי צמיחת שלשונים (ciliation) והפעלת מסלולים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ומקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחקר תרגומי: מקשרת תובנות מנגנוניות in vitro להקשרים תאיים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה בעלת יישום רחב לשינוי גנטי בסוגי תאים ראשוניים מאתגרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מסלולים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מניפולציה גנטית עם הדירות גבוהה ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן נתונים חסונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודוף מותאם סיכונים של מטרות ומודולטורים במסלולי איתות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות ראשוניות של נוירונים ובטכניקות אלקטרופורציה.
- נדרשת גישה לציוד אלקטרופורציה ולמיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך ניתוח.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים של טוהר הפלסמיד ושל פרוטוקולי הסרת המדיום.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים ראשוניים אחרים שקשיים להטרנספקציה באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- היעילות תלויה בבקרָה מדויקת של פרמטרי האלקטרופורציה ושל הכנת הדגימות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
