גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

בדיקת השביט נמצאת בשימוש נרחב להערכת גנוטוקסיות. הפרוטוקול שלנו מציע מספר יתרונות מתודולוגיים על פני בדיקת השביט הסטנדרטית. הטכנולוגיה שלנו מתמקדת בהחזקת החלקות השביט הסטנדרטיות במאונך ובעיבוד בקבוצות של 25 בארון תקשורת ייעודי.

זה כולל אלקטרופורזה, כך שהמיכל קטן יותר, משתמש בפחות חיץ, ויש לו קירור משולב. בהיותם מוחזקים במתלה, הג'לים העדינים על המגלשות מוגנים יותר ועוברים מתמיסה לתמיסה תוך 25 שניות. באמצעות פרוטוקול שביט הדם שלנו, חוקרים יכולים להשתמש בדקירת סיכה של דם כדי לחקור נזק לדנ"א בבני אדם, במינים אחרים ובמגוון רחב של חשיפות סביבתיות שעלולות להיות גנוטוקסיות.

כל אחד מהפורמטים השונים של בדיקת השביט המשתמשים בשקופיות מיקרוסקופ כתמיכה מוצקה בג'לים של השביט מקובלים על הגישה שלנו. החלק המכריע של טכניקה זו הוא טעינת דגימות לאחר ערבוב עם LMP agarose. יש להעמיס דגימות במהירות מבלי ליצור בועות ולכסות אותן מיד לפני שהן מתמצקות.

כדי להתחיל, להכין 0.6% נקודת התכה נמוכה agarose ב PBS ולהניח אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. סמן את הקצה הקפוא של השקופיות המצופות מראש עם שם, תאריך ופרטי טיפול באמצעות סמן או עיפרון קבועים. הניחו צלחת קירור על ספסל שטוח והכניסו שתי חבילות קירור קפואות למגירת ההזזה שמתחת למשטח המתכת.

לאחר מכן, הניחו את השקופיות על צלחת הקירור כדי לצנן מראש במשך דקה עד שתי דקות. צנטריפוגה ולהסיר את supernatant מן צינורות הדגימה ולהניח אותם מיד בחזרה על הקרח. החזירו את גלולת התא עם 200 מיקרוליטרים של 0.6% נקודת התכה נמוכה וערבבו על ידי פיפטה.

לאחר מכן, הוסיפו 80 מיקרוליטרים של תאים המכילים אגרוז על מגלשה מצוננת והניחו במהירות כיסוי על הג'ל. מניחים לג'ל להתייצב על צלחת הקירור למשך דקה עד שתי דקות. בינתיים, להכין 500 מיליליטר של פתרון עבודה של חיץ ליזה ויוצקים אותו לתוך צלחת ליזה.

לאחר שהג'לים התייצבו, הסירו את החלקות הכיסוי במהירות על ידי החזקה עדינה של המגלשה בין האגודל לאצבע והחלקת הכיסוי מהג'ל. לאחר מכן, מקם את השקופיות בתוך מנשא שקופיות עם כל סימני הנקודות השחורות על השקופיות הפונות לאותו כיוון. הניחו את מנשא ההחלקה בתוך צלחת התזה.

סוגרים את המכסה של צלחת הליזיס ומניחים אותה לדגירה. הסר בזהירות את מנשא השקופיות מצלחת התזה מבלי להפריע לג'לים. הניחו בעדינות את נושאת המגלשה בכלי כביסה טעון מראש במים קרים כקרח עם זיקוק כפול.

ודא שהשקופיות שקועות לחלוטין והשאר את ההתקנה למשך 30 דקות. הניחו חבילת קירור קפואה מתחת למיכל האלקטרופורזה כדי לשמור על טמפרטורת חיץ אופטימלית. לאחר מכן, הוסף פתרון עבודה אלקטרופורזה קר כקרח למיכל ולהעביר את נושאת השקופיות לתוכו.

כוון את השקופיות כך שהג'לים המכילים תאים יצביעו לעבר הקתודה. דגרו את השקופיות במיכל האלקטרופורזה למשך 20 דקות כדי לאפשר לדנ"א להירגע. לאחר מכן, הפעל את ספק הכוח כדי לבצע אלקטרופורזה במשך 20 דקות ב 1.19 וולט לסנטימטר.

לאחר השלמת האלקטרופורזה, כבה את ספק הכוח והסר את נושאת השקופיות ממיכל האלקטרופורזה. יש לאפשר למנשא ההחלקה להתנקז על נייר טישו למשך 30 שניות. לאחר מכן, הכניסו את נושאת השקופיות לתוך צלחת המכילה מאגר נטרול והשאירו אותה למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הניחו אותו בכלי כביסה המכיל מים קרים כקרח מזוקקים פעמיים והשאירו אותו למשך 20 דקות. לאחר השטיפה, הסירו את נושא המגלשה מהמים ותנו למגלשות להתייבש באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לייבש מחדש את המגלשות, העבירו את נושאת השקופיות לכלי כביסה המכיל מים קרים כקרח עם זיקוק כפול והשאירו אותו למשך 30 דקות.

לאחר מכן, הכניסו את נושא ההחלקה לתוך צלחת מכתים המכילה תמיסת פרופידיום יודיד של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. סוגרים את מכסה הכלי המכתים ודוגרים עליו במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, העבירו את נושאת המגלשה לצלחת נפרדת ושטפו אותה במים מזוקקים כפולים קרים כקרח למשך 20 דקות.

מוציאים את מנשא ההחלקה מהכלים ומייבשים אותו לחלוטין בחושך, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר. לאחר שהשקופיות מתייבשות לחלוטין, אחסן אותן בתיבת שקופיות בחושך עד שיהיו מוכנות לניתוח התמונה. קרטינוציטים אנושיים הוקרנו במינונים שונים של UVA ו- UVB או טופלו במי חמצן של 50 מיקרומולרים כדי לגרום נזק ל- DNA.

המתח האופטימלי היה 1.19 וולט סנטימטר, שכן הוא גורם לתגובה הרגישה ביותר ולאחוז הגדול ביותר של דנ"א זנב. דם שלם אנושי הוקרן במינונים שונים של UVA וטופל בריכוזים שונים של Fpg. בדיקת שביט אלקליין בתפוקה גבוהה גילתה כי הרמות האופטימליות של נזק לדנ"א הושרו עם ארבע יחידות למיליליטר של Fpg.

קו התאים הסרטניים בשחלות SK-OV-3 טופל בשילוב של ציספלטין ומי חמצן. התאים שלא נחשפו לא הראו נזק. חשיפה למי חמצן לבדה יצרה מומנט זנב זית ממוצע משמעותי בהשוואה לתאים שבהם הושרה ה-DNA intrastrand crosslinks.

לאחר טיפול עם 100-micromolar cisplatin, DNA intrastrand crosslinks גדל עם שיא ב 12 שעות, ולאחר מכן את הרמות ירד לאפס לאחר 30 שעות זה חיוני לשים את חבילת הקרח במיכל אלקטרופורזה דגירה מגלשות במשך 20 דקות כדי לשחרר DNA לפני אלקטרופורזה. שלב זה יעזור לדנ"א הפגום לנוע לפי זרם. הפעלת הבדיקה עם שקופיות שהונחו אנכית אפשרה לנו להפוך את בדיקת השביט לאוטומטית.

בנוסף, הטכניקה שלנו פישטה את בדיקת השביט לצורך מחקר.