ניתוח כמותי של תכונות ויסקו-אלסטיות של תאי דם אדומים באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופ defocus

מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור את ההתנהגות המכנית של אריתרוציטים, המאפיינת את הפרמטרים הויסקו-אלסטיים שלהם ואת תכונות זכוכית רכה עבור מספר תנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. השיטה שלנו המבוססת על תא בודד מאמתת הפניות וידאו באמצעות ערכי המתכת עבור גורם הצורה המקשר בין כוחות ותזוזות, לחצים ושריטות במשטח אריתרוציטים. התחילו בשפיכת שומן סיליקון על משטח טבעת הגומי באופן שמכסה את כל ההיקף.

לאחר מכן, הניחו את טבעת הגומי על הכיסוי כשצד השומן פונה לכיסוי. המתן חמש דקות לחיבור תקין, ומחזיקי הדגימה מוכנים לקבל את תרבית התא. לאחר מכן, עם פתרון של תאים שהוכנו בעבר בעקבות הפרוטוקול הכתוב, זרעו את התאים במחזיק הדגימה.

הוסף 0.2 מיקרוליטר של תמיסת כדור פוליסטירן בנפח 10% לפי נפח לדגימה. הניחו את הכיסוי השני מעל טבעת הגומי. סגור את ההתקנה וסיים את הכנת הדגימה.

לבסוף, העבירו את הדגימה כולה למיקרוסקופ. כדי להתחיל עם הניסוי, השתמש במערכת OT, ללכוד את הכדור עם לייזר OT, ולאחר מכן לחבר אותו כדי coverslip, קרוב לתא. לאחר מכן, לכוד כדור אחר וחזור על אותו תהליך התקשרות על-ידי לחיצה על הכדור כנגד פני התא, בסמוך לפני השטח העליונים וקרוב לקצה התא.

הוסף פונקציה סינוסואידלית של משרעת ותדרים משתנים. לאחר מכן, לחץ על כפתור "התחל", באמצעות השלב הפיזואלקטרי כדי לאפשר את התזוזה הפיזואלקטרית. שמור את כדור RBC במלכודת ושלח את הדגימה למחזור תנועות באמצעות הפונקציה הסינוסואידלית שנקבעה קודם לכן.

לניתוח, פתח את תוכנת ImageJ וייבא את הסרט כולו שהתקבל במהלך התנועות הסינוסואידליות. לחץ על התאם ולאחר מכן בחר סף אפשרויות. התאם את הסף עם שני פסי הגלילה, ובחר את כדור ההתייחסות בלחיצה על קובץ ואחריו מלבן.

לאחר מכן בכרטיסייה לנתח, לחץ על להגדיר מדידות"ובחר את מרכז המסה"אפשרות. לחץ שוב על הכרטיסייה ניתוח ובחר נתח חלקיקים. יופיע חלון חדש המכיל טבלה עם קואורדינטות xy למרכז המסה.

חזור על ההליך עבור הכדור השני המחובר למשטח RBC. פתח את תוכנת הניתוח וייבא את קבצי txt שהושגו בעבר. צור תרשים עם מרכזי המסה על ציר y וזמן על ציר x.

התווה את התוצאות על גרף באמצעות ציר x עבור קבוע איבוד, המסומן ב- K ראשוני כפול, וציר y עבור קבוע אחסון, המסומן ב- K prime. ראשית, עבור רכישת וידאו, להזיז את השלב piezoelectric בכיוון xy, באמצעות התוכנה כדי לחפש תא מבודד מחובר coverslip. ללכוד ולחבר כדור פוליסטירן בקוטר ידוע למשטח RBC.

לאחר מכן, באמצעות השלב הפיזואלקטרי, הזז את החרוז הלכוד המחובר למשטח RBC כדי לעוות את התא, ולאחר מכן חבר את החרוז לשפת הכיסוי. כעת, שנו את מיקום ציר z כדי למצוא את התמונה הממוקדת. לאחר תיקון המיקום, השתמש בתוכנת המצלמה כדי ליצור סרט של התא כולו.

לאחר מכן, הזז את מיקום ציר z שני מיקרומטרים למטה או למעלה כדי לקבל תמונה לא ממוקדת עבור התא שנבחר. לבסוף, מבלי לשנות את מיקום ציר z, חפש אזור ללא תאים כדי לחזור על אותו הליך, וצור סרט של רקע התמונה. לרכישת תמונת ניגודיות, תחילה מצא את הערך של N אפס, לחץ על סמל בחירת המצולע, ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה נתח ובחר מדידה.

לאחר מכן, השתמש במשוואת הניגודיות כדי לקבוע N תמונה פחות N אפס, ובצע זאת על ידי בחירת math"under process, ואחריו חיסור. מאוחר יותר, חלק את התוצאה ב- N אפס פחות B.לבסוף, מצא את הניגודיות עבור התמונות הממוקדות והלא ממוקדות. כעת, השתמש בהתמרת הארטלי כדי להשיג את עובי RBC.

ב- ImageJ, לחץ על תהליך, ואחריו אפשרויות FFT"ו- FFT, ולאחר מכן בחר FHT. לאחר מכן בצע את ההמרה ההופכית FHT על ידי בחירת תהליך, ואחריו FFT"ו- FFT. השתמשו בתמונה שתיווצר לקבלת פרופיל הגובה.

לאחר מציאת התמונה המכילה את פרופיל הגובה של RBC, השתמש בניגודיות הממוקדת של שני מיקרומטרים כדי ליצור ערכה של שתי תמונות ב- ImageJ. כדי למצוא את גורם הצורה, השתמש במאקרו מותאם אישית של ImageJ כדי לנתח את הערימה. המאקרו יספק טבלה עם מיקום הקצה, ההיקף, ההופכי של ההיקף ותמונה של התא המנותח.

בדקו אם הקצוות של תמונה זו דומים לקצוות של איור ההפניה. אחרת, חזור על ההליך והשתמש בסכום ההופכי של ההיקף כדי למצוא את גורם הצורה. התחל על-ידי ארגון נתוני הניסוי בטבלה.

צור טבלה חדשה בתוכנת הניתוח על-ידי לחיצה על כרטיסיית הקובץ. קבע 10 עמודות שונות עבור הפרמטרים. כדי להתוות את העקומה G prime ו- G כפול prime בתוכנת הניתוח, השתמש בנתונים מהטבלה הקודמת ולחץ על כפתור plot".

כדי לקבל פרמטרים גמא ו- GM, לחץ על הכרטיסייה התאמת עקומה ובחר fit1"כדי לפתוח חלון חדש. בחר את הריבוע, לחץ על כפתור ההגדרה והקלד את המשוואה. לחץ על OK"כפתור בשני החלונות, ואת ההתאמה יופיע.

לאחר מכן, ליצור שתי חלקות אחרות, כלומר G ראשוני ו G פריים כפול כפונקציה של אומגה. מקם את קווי השגיאה רק על ציר y, כפי שהודגם בעבר. חזור על הליך התאמת העקומה, בחר G"option.

לחץ על הגדרת עקומה"תחת התאמה כללית ולאחר מכן כתוב את המשוואה הנוגעת בדבר. לבסוף, לחץ על אישור, והתאמת עקומה תופיע יחד עם הערכים עבור אפס אלפא ו- G. שוב, בצע הליך התאמת עקומה נוסף.

בחר G"option, לחץ על הגדרת העקומה"תחת התאמה כללית, ולאחר מכן כתוב את המשוואה הנוגעת בדבר. לבסוף, לחץ על אישור, והתאמת עקומה תופיע. האיור מציג את הקבוע האלסטי של האחסון כפונקציה של הקבוע האלסטי האבוד.

התלות הליניארית שנצפתה מדגימה כי משטח RBC יכול להיחשב כחומר זכוכית רך. על-ידי החלת הערכים עבור גורם הצורה הכולל של התא ועובי פני השטח של RBC, ניתן לקבוע את הערכים עבור אלפא המעריכי. טכניקה זו עשויה לספק את הבסיס לשיטות אבחון חדשניות המתאמות שינויים בתכונות ויסקו-אלסטיות של אריתרוציטים עם שינויים בזרימת הדם של אנשים עם פתולוגיות שונות.