חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים
31 במרץ 2022
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.
טכניקת הבהירות שתוארה לראשונה בשנת 2013 היא טכניקת ניקוי רקמות המאפשרת דגימות של כמויות גדולות יותר של תאים, כלי דם, כך שאפילו חלבונים כאלה ברזולוציה של תא בודד בפרוסות מוח עבות. טכניקה זו מאפשרת לחקור מבנים מיקרוסקופיים שלמים על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף. פרוטוקול זה הוא שבב פשוט וצינור פשוט עבור רקמות ברורות.
טכניקה זו יכולה לשמש לפינוי רקמות במערכות אחרות בנוסף לרקמות המוח. כדי להתחיל, אטמו את הצינור ואת המכסה באמצעות פרפילם ונקבו שני חורים בכובע. לאחר מכן להעביר גז חנקן מהמיכל באמצעות צינור גמיש עם קוטר פנימי של חמישה מילימטרים ומחט של 19 מד המחוברת בקצהו.
התחילו לגזע על ידי חיבור הצינור לצינור ואפשרו חילופי גזים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נתקו את הצינור ומיד אטמו את החורים בחימר דוגמנות. לאחר מכן מעבירים את הצינורות האטומים של דגה לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 1/2 שעות כדי לפלמל את תמיסת ההידרוג'ל.
הוציאו את המוח מהצינור. באמצעות מגבוני מעבדה, הסר את ההידרוג'ל הפולימרי סביב המוח כדי להבטיח שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של המוח. חלקו את המוח לפרוסות עבות המכילות את כל תחומי העניין.
מכניסים את הפרוסות לתמיסת הניקוי הראשונה ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. בינתיים, הכינו צינור מחורר כדי למקם את המוח. שים את הצינור המחורר בכוס מלאה בתמיסת ניקוי שנייה במכשיר ערבוב.
לאחר מכן הניחו את המוח בכוס ואטמו אותו בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה. לאחר שהרקמה הופכת שקופה, העבירו את המוח ל-PBST באינקובציה ב-37 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-70 סל"ד למשך 24 שעות. החליפו את התמיסה ב-PBST טרי והמשיכו את הדגירה עוד 24 שעות.
לאחר מכן העבירו את המוח ל-PBS בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הסר את המוח מ- PBS והעבר אותו לתמיסת התאמת מקדם שבירה. הדגירה של המוח ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
ראשית, מקם את הדגימה באמצע השקופית. באמצעות דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות.
כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח אחת עד שתי טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות. בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלקה העליונה בהחלקת כיסוי, הניחו אותו באופן שווה ככל האפשר ואז מלאו את התא בתמיסת ההתאמה של מקדם השבירה. סגרו את הפער בדבק חם.
אם דפנות הדבק החם משתרעות מעבר לגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים. אם מטרת טבילת שמן משמשת להדמיה, הוסיפו עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל החלקת הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תפונה.
פרוסות מוח ברורות הוכנו באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין אוכלוסיות של אסטרוציטים ותאי עצב באזור CA1 של היפוקמפוס עכבר. כל האסטרוציטים ביטאו tdTomato ותאי עצב מעוררים ביטאו H2B-GFP בגרעינים שלהם. התא שהוכן עבור הרקמה המובהקת היה אופטימלי להדמיה תחת שני פוטון או מיקרוסקופ קונפוקלי.
באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים, נצפו יותר מ-300 אסטרוציטים בקטע מנוקה של אזור CA1 של היפוקמפוס העכבר. האסטרוציטים ההיפוקמפוסים בתאים אדומים ופירמידאליים, סומטה בירוק היו גלויים ועבים, רקמה שקופה המייצגת את הקרבה המרחבית בין שני סוגי התאים הללו. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר סורק, צרורות אקסונאליים מתאי עצב מעוררים אותרו על פני חצי כדור שלם.
צרורות ירוקים אותרו מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופות הסופר-מימיות. הצרורים האדומים אותרו מגופי המאמילרים לעבר מקורם בהיפוקמפוס האוורור. גורמים, כגון טמפרטורה, ריכוזים וזמן דגירה השפיעו על תוצאות הליך הבהירות.
לכן, הדיוק בכל שלב של הפרוטוקול חיוני להצלחת השגת רקמה ברורה. באמצעות טכניקה זו, אנו מודדים את המרחקים בין נוירונים לאסטרוציטים בכמה מבני מוח. פרוטוקול זה איפשר ניתוח של שניים עד שלושה סדרי גודל של יותר תאים מאשר במחקרים קודמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה משתמש בשיטת CLARITY בשילוב עם טרנסדוקציה של וקטורים ויראליים כדי לחקור את היחסים המרחביים בין נוירונים לאסטרוציטים בהיפוקמפוס של עכבר. באמצעות הפיכת הרקמה לשקופה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון מספר רב יותר של תאים, ובכך לחשוף תובנות לגבי ארגון תאי ואינטראקציות תאיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות להבהרת רקמות
- דימות תאי
רקע
- טכניקת ה-CLARITY מאפשרת ויזואליזציה של רקמת מוח ברמה התאית.
- היא מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות גדולות של נוירונים ואסטרוציטים ברקמות שלמות.
- שיטה זו משפרת את הבהירות של פרוסות מוח עבות בהשוואה לשיטות דימות מסורתיות.
- המחקר מדגיש את תפקידה של שקיפות הרקמה בהבנת הארכיטקטורה הנוירונלית.
מטרת המחקר
- לבחינת הקשרים המבניים בין אסטרוציטים לנוירונים בהיפוקמפוס של עכבר.
- למדידת המרחקים בין סוגי תאים שונים במבני מוח שונים.
- להדגמת יעילות שיטת CLARITY לדימוי תאי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- במחקר נעשה שימוש בטכניקת CLARITY להשקיפות רקמות בחתכי מוח.
- נעשה שימוש ברקמת היפוקמפוס של עכבר כדי להדמיות של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים.
- לא הוזכרו תהליכי עבודה של מולטי-אומיקה (multiomics).
- שלבי המפתח כללו ניקוז גזים, פולימריזציה של הידרוג'ל ודגירה בתמיסות להשקיפות.
- הרקמה הודמייתה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ודו-פוטונית.
תוצאות עיקריות
- מעל 300 אסטרוציטים הודגמו בחתכים של היפוקמפוס שעברו הבהרה.
- ההקשר המרחבי של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים נקבע, והראה את קרבתם זה לזה.
- נצפו צרורות אקסונים משמעותיים בין אוכלוסיות נוירונים ברקמות שעברו הבהרה.
- גורמים שונים השפיעו על מידת הבהירות של הרקמות, מהמדגיש את הצורך במתודולוגיה מדויקת.
מסקנות
- מחקר זה מדגים כי שיטת CLARITY יכולה לשפר משמעותית את הוויזואליזציה של קשרים תאיים במוח.
- הממצאים מאפשרים הבנה טובה יותר של הארגון המרחבי של נוירונים ותאי גליה.
- לתובנות שהתגלו באמצעות שיטה זו עשויות להיות השלכות על מחקר במנגנונים נוירונליים ועל מודלים פוטנציאליים של מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות מרחביות בין אסטרוציטים לנוירונים ברקמת מוח שלמה נותן מענה לפער קריטי בתיקוף מוקדם של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ובצמצום סיכונים מכניסטיים. השילוב של סימון באמצעות וקטורים ויראליים עם שקיפות רקמה בשיטת CLARITY מאפשר ניתוח כמותי רחב היקף של דומיינים תאיים, ובכך תומך בביטחון חזוי בתגליות נוירוביולוגיות. יכולת זו משפרת את תעדוף הפורטפוליו על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים להרחבה על אינטראקציות בין סוגי תאים הרלוונטיים למודלים של מחלה ולתיעדוף מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה כמותית של יחסי המרחב בין אסטרוציטים לנוירונים באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת גבולות הדומיין התאי ומדדי קרבה.
- מקל על תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות סימון ודימיון של סוגי תאים המוגדרים גנטית.
- מספק נתונים בעלי תוכן גבוה לביטחון חיזוי בבחירת מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין מערכות רקמת מוח תקינות ומאומתות עבור בדיקות מבוססות דימוי בהמשך התהליך.
- מבצע סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות לצורך מדידות מרחביות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר דימוי בר-הרחבה של מאות עד אלפי תאים לדגימה לצורך סריקה רחבה (screening) חסונה.
- תומך בפיתוח בדיקות להערכת תרכובות המכוונות לאינטראקציות בין נוירונים לגליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי המיפוי המרחבי למודלים של מערכת העצבים המרכזית הרלוונטיים למחלה, לצורך המשכיות תרגומית.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת מדדי ייחוס כמותיים לאינטראקציות בין סוגי תאים.
- תומך בגילוי סמנים ביולוגיים באמצעות מיפוי ברזולוציה גבוהה של דומיינים תאיים.
- מאפשר רצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני בפורטפוליו של מחקרים בנוירוביולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח מרחבי עתיר-תוכן של אוכלוסיות תאי מוח המוגדרות גנטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים ומבהיר מסלולים מכניסטיים ברקמות של ה-CNS.
- סריקה: מספק תוצאות מרחביות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך בדיקת מוכנות של מטריצות סריקה (assays) וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדדי קרבה תאית ותפוסה דומיינית (domain occupancy) לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני מיפוי מרחבי למודלים של מחלות ולאסטרטגיות של ביומארקרים כאשר המערכת תומכת בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה (workflow) ניתן להרחבה ולשימוש חוזר להבהרה (clearing) ודימוי של רקמות CNS במספר תוכניות מחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הבהרת רקמות והדמיה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון באמצעות מתן אפשרות להפקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים נוירוביולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציה של וקטורים ויראליים, שקיפות רקמות (tissue clearing) ומיקרוסקופיה מתקדמת.
- דורש גישה לפלטפורמות דימוי דו-פוטוניות או קונפוקאליות ולתשתיות אנליטיות.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של הפרוטוקול לצורך הדירות (reproducibility) בין צוותים שונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמות עבור אזורי מוח שונים או מערכות מודל שונות.
- דיוק הפרוטוקול הוא קריטי; הטמפרטורה, ריכוזי הריאגנטים והתזמון משפיעים ישירות על איכות הנתונים.
