הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה
5 במאי 2022
נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.
פרוטוקול זה מאפשר הערכה של תפקוד המיטוכונדריה בתוך העצב על ידי פירוק המיטוכונדריה המבודדת, הליך מאתגר ברקמה קטנה המכילה מספר מוגבל של מיטוכונדריה. הטכניקה מספקת אפשרות לנתח פונקציות מיטוכונדריה כגון צריכת חמצן וייצור ROS בו זמנית במיטוכונדריה משומרת באתרה. עם מספר רב של מצעים, מעכבים ופרוטוקולי תכנון uncoupler.
מספר מחלות חולקות תפקוד מיטוכונדריאלי, במיוחד נוירופתיות המושרות על ידי סוכרת מסוג שתיים או כימותרפיה. במחלות אלה, ליקויים של זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי הם הסימן היחיד המכתיב את התפתחות המחלה. שיטה זו מספקת תובנות על נוירוביולוגיה, ביוכימיה ופרמקולוגיה, עם חקירת מנגנוני מחלות מיטוכונדריאליות, חיפוש אחר טיפולים, כגון מאיצים מיטוכונדריאליים או כאב נוירופתי.
כדי להתחיל, כייל את חיישני החמצן על ידי צנרת 2.1 מיליליטרים של מאגר MR לכל תא. סגרו אותו עם הפקקים ומשכו אוויר לתוך התא עד שנוצרת בועה. יש לערבב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת במצב כיול עד ששטף החמצן למסה מתייצב.
באמצעות תוכנת HRR לבצע כיול אוויר של חיישני החמצן הקוטבוגרפיים על פי הוראות היצרן. להכנת רקמות, מניחים את העצב הסיאטי בצלחת פטרי עם מספיק חיץ TP כדי לכסות אותו. להחזיק קצה אחד של העצב עם מלקחיים ועם זוג מלקחיים אחר למשוך את צרורות העצבים אופקית.
ראשית, להעביר את הרקמה המוצגת לתוך צלחת קטנה המכילה מאגר TP מיליליטר אחד עבור חדירת רקמות. כדי להתחיל permeabilization, להעביר את הרקמה עם מלקחיים למנה אחרת המכילה מיליליטר אחד של חיץ TP, המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר של סאפונין. מניחים את הצלחת בשייקר מיקרו-פלטה ונותנים לה לערבב בעדינות במשך 30 דקות.
לאחר מכן, מעבירים את הרקמה עם המלקחיים למנה טרייה המכילה מאגר MR מיליליטר אחד, ותנו לה לערבב בעדינות במשך 10 דקות. העבר את הרקמה עם מלקחיים לתא HRR מכויל. מלאו את תאי ה-HRR ב-2.1 מיליליטרים של מאגר MR.
הוסף את Amplex Red ו peroxidase לריכוז סופי של חמישה מיקרומולאר, ושתי יחידות לכל מיליליטר, בהתאמה. לאחר מכן, הוסף את העצב הסיאטי החדיר. חברו את החיישנים הפלואורסצנטיים של המכשיר.
לאחר מכן, כבה את האורות בחלק הבקרה של התוכנה ולחץ על התחבר לאוקסיגרם "עבור לערוך פרוטוקולים" בתוכנה והכנס את משקל הרקמה. עבור אל הפריסה ובחר את האפשרות הספציפית של שטף ליחידת דגימה." לאחר מכן בחר מגרשים כדי לגשת בו זמנית לקריאת צריכת החמצן, ובמידת הצורך, לייצור מי חמצן.
המתן כ- 10 דקות. להזריק שני פולסים של מי חמצן, כל אחד לריכוז סופי של 260 מיקרומולר לכיול החדר. הזריקו 20 מיקרוליטרים של סוקינט, מצע קומפלקס מיטוכונדריאלי II, כדי להפעיל את מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית.
הוסף 20 מיקרוליטרים של ADP כדי להפעיל סינתזת ATP. ברצף, הוסף חמישה מיקרוליטרים של ציטוכרום c כאינדיקטור לשלמות הממברנה. Titrate עם aliquots של 0.2 מיקרוגרם לכל מיליליטר של אוליגומיצין עד שלא נצפתה ירידה נוספת בצריכת החמצן.
Titrate עם aliquots של 0.5 micromoles לליטר FCCP, uncoupler המיטוכונדריה, עד לא נצפתה עלייה נוספת בצריכת החמצן. כדי לסיים את הניסוי להזריק שני מיקרוליטרים של אנטימיצין A, לעשות ריכוז סופי של חמישה מילימולר ולחכות שהזרימה תתייצב. עבור אל שורת הפקודות.
חפש רב-חושי"בתוכנה. לחץ על פקד "ואז לחץ על שמור קובץ" והתנתק. פתח את הקובץ שנשמר ובחר את שטף החמצן לכל מגשי מסה כדי לקבל את תוצאות צריכת החמצן הניסיונית.
בחר באופן ידני את החלון בין הזרקות על ידי לחיצה על לחצן Shift בתוספת העכבר השמאלי. עבור אל סימנים, ובחר נתונים סטטיסטיים כדי להמחיש את התוצאות עבור כל זריקה של מצעים, מעכבים ופרוטוקול uncoupler. עבור ייצור מי חמצן לבצע את אותו הליך עם עקבות שיפוע המגבר.
הירידה בפוטנציאל הממברנה שמקודמת על ידי פעילות הסיתאז ATP האיצה את צריכת החמצן. התוספת של ציטוכרום C אקסוגני קידמה רק גירוי מינימלי של הנשימה, ואישרה את שלמות הממברנה החיצונית המיטוכונדרית להכנה זו. זרמי חמצן מוחלטים נרשמו ורק עלייה של 6.3% נצפתה בנשימה, מה שמעיד על איכות טובה של הכנת הרקמה.
צריכת החמצן וייצור ה-ROS נמדדו בו זמנית בנוכחות מצעים שונים המספקים דלק למערכת הובלת האלקטרונים. התוספת של פירובט ומלט לקומפלקס המיטוכונדריה הגבירה את הנשימה. ותוספת נוספת של סוקסינט לקומפלקס II גם מגדילה את צריכת החמצן.
לכן ניתן היה לבדוק מצעים אחרים. גם ייצור ה-ROS גדל, מה שמעיד על דליפת חמצן ממערכת הובלת האלקטרונים. תוספת של אדנוזין דיפוספט בריכוז רוויה הגדילה את צריכת החמצן והניעה את היווצרות ה-ATP, והפחיתה את ייצור ה-ROS.
לעומת זאת, אוליגו טיטרציה הפחיתה את צריכת החמצן והגבירה את ייצור ה-ROS. זה הציע כי עצב סיאטי מחלחל יכול לשכפל את הקשר הסטנדרטי בפיזיולוגיה המיטוכונדרית. התוספת של FCCP ורטינון, התואמת את השינויים הצפויים בשטף החמצן, מאשרת כי הפיזיולוגיה המיטוכונדרית והפרופיל הביו-אנרגטי נשמרו בעצב הסיאטי המחלחל.
הצעד החשוב ביותר הוא להכין בעדינות את חלק הרקמה, לוודא שכל פתחי התאים מנוקים כראוי. שינויים בתפקוד המיטוכונדריה יכולים לנבוע מתפקוד לקוי או ממספר מיטוכונדריאלי נמוך יותר. לכן פעילות סינתאז מצוטטת ואישור תכולת דנ"א מיטוכונדריאלי על ידי PCR מומלצים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר להעריך את התפקוד המיטוכונדריאלי ברקמות עצביות באמצעות בידוד מיטוכונדריה, משימה מאתגרת בשל מספרן המוגבל. הוא מאפשר ניתוח סימולטני של צריכת חמצן מיטוכונדריאלית ויצירה של רדיקלים חופשיים של חמצן (ROS) in situ.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- פרמקולוגיה
רקע
- תפקוד מיטוכונדריאלי הוא קריטי לבריאות התא.
- נוירופתיות, כגון אלו המושרות על ידי סוכרת מסוג 2 או כימותרפיה, כוללות לעיתים קרובות תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי.
- ליקויים בזרחון חמצוני יכולים לקבוע את התקדמות המחלה.
- הבנת מנגנונים מיטוכונדריאליים עשויה להוביל לטיפולים פוטנציאליים.
מטרת המחקר
- להערכת שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית ברקמות עצביות.
- למדידת ייצור ROS בעצבי סיאטיקה (sciatic nerves) חדירים.
- לבחינת מנגנונים של מחלות מיטוכונדריאליות וטיפולים פוטנציאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רספירומטריה ברזולוציה גבוהה בשילוב עם חיישני פלואורסצנציה.
- שימוש בסובסטראטים, מעכבים ומפרידי זרם (uncouplers) מרובים.
- בידוד מיטוכונדריה מרקמות עצביות.
- מדידה סימולטנית של צריכת חמצן ויצירת ROS.
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של תפקוד מיטוכונדריאלי ברקמות עצביות.
- הדגמה של מדידה סימולטנית של רמות חמצן ו-ROS.
- תובנות לגבי תפקידה של תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי בנוירופתיות.
- פוטנציאל לפיתוח טיפולים המכוונים לבריאות המיטוכונדריה.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר התפקוד המיטוכונדריאלי ברקמות עצבים.
- היא משפרת את ההבנה של נוירוביולוגיה ומנגנוני מחלות.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתמקד בהתערבויות טיפוליות למחלות הקשורות למיטוכונדריה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
רספירומטריה ברזולוציה גבוהה בעצב סיאטיק חדיר מאפשרת הערכה כמותית וישירה של תפקוד מיטוכונדריאלי בדגימות קטנות של עצבים פריפריאליים הרלוונטיות למחלה. גישה זו נותנת מענה לפער קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ותיקוף מטרות לפיתוח תרופות הקשורות לנוירופתיה, על ידי מדידה סימולטנית של צריכת חמצן ויצירת מיני חמצן רבייקטיביים (ROS). השיטה תומכת בביטחון חיזוי לגבי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה כמניע מכניסטי של נוירופתיות, ובכך מסייעת בתעדוף תיקי פיתוח ובבדיקת היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מצבי נשימה מיטוכונדריאליים ויצירת ROS ברקמת עצב שלמה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית עבור יעדים לטיפול בנוירופתיה על ידי כימות של תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי.
- מקל על תיקוף תפקודי של יעדים באמצעות פרופיל תגובה לסובסטראטים ומעכבים.
- מספק ביטחון תחזיתי לגבי מעורבות מיטוכונדריאלית בהתקדמות המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכונן בדיקה כמותית הניתנת לשחזור עבור תפקוד מיטוכונדריאלי בעצבים פריפריאליים.
- מספק מדדים סטנדרטיים לצריכת חמצן ולהפקה של ROS בתנאים שונים.
- תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות המכוונות למסלולים מיטוכונדריאליים.
- מאפשר הערכה מהימנה של מודולטורים מיטוכונדריאליים במערכות הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדים תפקודיים של מיטוכונדריה למודלים של מחלות נוירופתיה לצורך פיתוח סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של התערבויות המכוונות למיטוכונדריה.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון המבוסס על מדדים מיטוכונדריאליים כמותיים.
- משפר את הפחתת הסיכונים החזויה עבור טיפולים המיועדים לתסמונות של תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי בנוירופתיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה ישירה של התפקוד המיטוכונדריאלי במודלים של עצבים פריפריים, ובכך תומכת הן במחקרים מכניסטיים מוקדמים והן בהתאמה של ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת מצבי נשימה מיטוכונדריאליים ופלט של ROS כדי להבהיר מנגנוני מחלה.
- סריקה: מספק פלטי בדיקה סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של צריכת חמצן ו-ROS לצורך השוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים של נוירופתיה עם נקודות סוף מיטוכונדריאליות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכה מיטוכונדריאלית לאורך תוכניות מחקר בנוירופתיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים לנוירופתיה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות תפקוד מיטוכונדריאלי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ולהקצאת הון באמצעות אספקת נתונים מיטוכונדריאליים חסונים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של נכסים המכוונים למיטוכונדריה בקווי פיתוח לנוירופתיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה וטיפול בעצבים פריפריאליים.
- נדרש מיכשור ייעודי לגילוי סימולטני של חמצן ו-ROS.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת רקמה ופרוטוקולי בדיקה.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי עצבים שונים או למודלים של מחלות.
- יש להתחשב במגבלות גודל המדגם ובתוכן המיטוכונדרי לצורך פירוש הנתונים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:19
Calibration of Polarographic Oxygen Sensors for High-Resolution Respirometry (HRR)
1:56
Dissection and Permeabilization of the Sciatic Nerve
2:58
Oxygen Consumption and Reactive Oxygen Species (ROS) Production Determination
5:51
Results: Assessing the Mitochondrial Oxygen Consumption by the Permeabilized Sciatic Nerve
7:41
Conclusion
