הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ

בעבר נעשה שימוש במודלים של מבחנה או ex vivo חסרים רכיבי תאי עור ומורכבות של רקמת העור. בדיקת SCAD זו של ex situ מתגברת על מגבלה מוגדרת ומאפשרת לחקור את התפתחות הצלקות מחוץ לחיה פצועה. בדיקת SCAD מאפשרת הדמיה של נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה של העור.

זה מאפשר ספריות סינון של מפעילים או מעכבים כדי להבין את הבסיס המכניסטי של היווצרות צלקות. בדיקות סינון בתפוקה גבוהה של ספריות שטוחות תוך שימוש במודל SCAD בהבנת התהליך הבסיסי וקורס המולקולות המעורב בתיקון פצעים. בדיקת ה-SCAD קלה לביצוע באמצעות חומרי העור.

עבור צלקת עקבית, מומלץ לבחור עור יום אפס או יום אחד לאחר הלידה. לאחר הקרבת יום אפס לאחר הלידה או יום אחד של גור שזה עתה נולד, השתמשו באזמל כירורגי סטרילי כדי לבלות בזהירות את העור הגבי בעובי מלא של 1.5 על 1.5 ס"מ עד לשכבת שרירי השלד. מקלפים את העור באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ומבטיחים כי החיתולית השטחית שלמה עם שריר panniculus carnosus הבסיסי.

לשטוף את הרקמה שנכרתה עם 50 עד 100 מיליליטרים של DMEM F-12 קר בינוני כדי להסיר דם מזהם. לאחר מכן, שטפו את הרקמה בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס כדי לשמור על כדאיות הרקמות והתאים. מניחים את העור הפוך עם חיתולית שטחית למעלה בצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה מדיום DMEM F-12.

לאחר מכן, באמצעות אגרוף ביופסיה חד פעמי של שני מילימטרים, מוציא את הבלו על פיסות עור עגולות בעובי מלא כדי ליצור רקמות מפוספסות, מה שמבטיח כי החיתולית השטחית תהיה שלמה עם שריר ה-panniculus carnosus הבסיסי עד האפידרמיס. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום מלא DMEM F-12 טרי ללא פנול אדום לכל באר של צלחת בעלת 96 בארות. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים ומטביעים באופן מלא רקמה בודדת הפוכה לבארות של צלחת בת 96 בארות.

מעבירים את הצלחת לחממת תרביות תאים המתוחזקת בתנאים סטנדרטיים. בימים השני והרביעי של התרבית, יש להסיר את המדיום ולהשאיר 10 מיקרוליטרים בבאר ולהוסיף מדיום מלא DMEM F-12 טרי שחומם מראש יחד עם תרכובות הטיפול כדי לשמור על המשך תנאי הכדאיות של התאים והרקמות. להדמיה חיה של SCADs, הכינו 30 מיליליטרים של תמיסת אגרוז נמסה נמוכה של 2%-3% ב-PBS בבקבוק זכוכית על ידי חימום במיקרוגל.

לאחר הרתיחה, מיד להעביר את הבקבוק ולקרר את תמיסת אגרוז נוזלי באמבט מים 40 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו את רקמת ה-SCAD עם החיתולית או הצלקת הפונה כלפי מעלה אל מרכז המנה בקוטר 35 מ"מ. לאחר מכן הטמיעו את ה-SCAD בטמפרטורת החדר על ידי שפיכה איטית של אגרוז נוזלי של 40 מעלות צלזיוס על הרקמה באמצעות קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר.

אגרוז מתפלמר תוך שתי דקות. לאחר הפילמור, הוסף שני מיליליטרים של מדיום מלא DMEM F-12 מחומם מראש. לאחר מכן באמצעות קונפוקל או מיקרוסקופ מולטי-פוטון המצויד במערכות דגירה מתאימות המוסברות בכתב היד, רכשו תמונות בהילוך מהיר של יום אפס עד היום הראשון.

לקצירת רקמות, לשטוף את הרקמות בנקודות זמן רלוונטיות על ידי החלפת המדיה ב- PBS סטרילי. באמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים כל SCAD לצינור מיקרו-צנטריפוג של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטרים של 2% פרפורמלדהיד כדי לתקן את הרקמות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הרקמות שלוש פעמים עם PBS לפני שתמשיכו לצביעה אימונופלואורסצנטית דו-ממדית או תלת-ממדית כמתואר בכתב היד של הטקסט.

התמונות הייצוגיות של SCADs בשדה בהיר של כל ההרכבה בימים אפס וחמישה מוצגות כאן. צביעת הטריכרום של המאסון בחתכי רקמות אנכיות חושפת חתימות של הצטלקות רקמות, כיווץ רקמות והצטברות של מטריצה חוץ-תאית בליבת הצלקת בימים אפס וחמישה. הכתם האימונופלואורסצנטי של SCADs בימים אפס וחמישה מוצגים.

מצלקת בשלב מוקדם ומאוחר, הפיברובלסט החיובי המושרש מוצג בירוק ופיברובלסט שלילי מושרש באדום. עבור הדמיה תלת מימדית, הרקמות הוטמעו בתמיסת אגרוז ומעליהן PBSGT. התמונות הייצוגיות מדגימות לוקליזציה בלעדית של חלבון N-cadherin באתר הצלקת של SCAD ביום החמישי.

מערך ההדמיה התלת-ממדי של קיטועי הזמן המצויד בתא דגירה הציג אירועים מוקדמים של התקדמות נחילי הפיברובלסט במהלך 12 השעות הראשונות או בשלבים המוקדמים של התפתחות הצלקת. הייצוג הגרפי של מסלולים תאיים חד-תאיים במעקב של פיברובלסטים בודדים על התפתחות צלקות מוצג כאן. חשוב מאוד למקם את רקמת ה-SCAD במהופך בתוך צלחת הבאר כך שהפאסיה תפנה כלפי מעלה.

כישלון לעשות זאת יגרום לשינויים בלתי נמנעים בדפוסי ההגירה. הליך זה מאפשר לבחון שכבות עוריות לטיפולים או לתרבית באמצעות מודולטורים כימיים, נוגדנים מנטרלים או שיטות ויראליות. זה עוזר בהערכת תגובות פיברוטיות פתולוגיות במסגרות רפואיות מגוונות.

הראינו את הביטוי של קונקסין-43 ו-N-cadherin כמולקולות מפתח המעורבות בגיוס החיתולית לאחר הפציעה. מתודולוגיית SCAD מאפשרת זיהוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות לצמצום הצטלקות ופיברוזיס.