שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות
5 במאי 2022
אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.
אנו משלבים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מיקרופלואידיקה כדי לחקור כיצד חלבונים קושרי אקטין מווסתים את ההרכבה, ואת הפירוק, של חוטי אקטין. באמצעות מיקרופלואידיקה, אנו מסוגלים לכמת תגובות המתרחשות על עשרות חוטי אקטין בודדים בו זמנית, תוך שליטה מדויקת בתנאים ביוכימיים ומכניים. זכור כי תמיסות מוזרקות תחילה במקביל עד שהן מגיעות לתא, ולאחר מכן, חוטים נחשפים ברצף לכל תמיסה על ידי שינוי הגדרת הלחץ.
כדי להתחיל את ההכנה של polydimethylsiloxane, או PDMS, הרכבה תא, לחמם מראש את הצלחת החמה ל 100 מעלות צלזיוס. חשפו תא PDMS אחד שנוקה וכיסוי זכוכית אחד מחליק בצלחת פטרי נקייה לאור אולטרה סגול למשך שלוש עד חמש דקות בחומר ניקוי UV עמוק. בסיום, מקם את תא ה- PDMS מעל החלקת הכיסוי כך ששני המשטחים החשופים ישירות ל- UV יוכנסו במגע.
כדי להסיר בועות אוויר הלכודות בממשק החלקת הכיסוי של PDMS, לחץ בעדינות על פני השטח של התא באצבע. לחצו חזק על פינות וצדדים, וודאו שתקרת החדר לא תבוא במגע עם משטח הזכוכית. הניחו את החדר עם תחתית הזכוכית הפונה לצלחת החמה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
לאחר מכן השתמשו בתא באופן מיידי, או אחסנו אותו בצלחת פטרי נקייה למשך שבוע. כדי לשטוף את צינורות הכניסה והיציאה, מלאו צינור מאגר אחד של 2 מיליליטר ב-300 מיקרוליטרים של חיץ F, הברגו אותו על מחזיק המיקרופלואידים והגדירו את הלחץ ל-300 מיליברס. תן חמש עד שמונה טיפות של F-buffer ללכת לבזבוז, ולאחר מכן להגדיר את הלחץ לאפס ולחזור על ההליך עבור כל ערוץ.
לאחר מכן, הגדר את הלחץ ליציאה בצינור המאגר ארבעה עד 50 מיליברס, ברגע שיוצאת טיפה מקצה הצינורות, חבר את הצינורות לשקע של תא PDMS. כאשר הנוזל ממלא את התא ויוצא מכל הכניסות, הגדר את לחץ היציאה ל -20 מיליברס. מאוחר יותר, הגדר את הלחץ עבור צינור המאגר ל 1 עד 50 millibars.
כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר, ודאו שהטיפה יוצאת מהצינורות ומכניסת ה-PDMS לפני שאתם מחברים את הצינורות לכניסה. הגדר את הלחץ של המפרצון ל 30 millibars. לאחר חיבור המפרצים שניים ושלושה כפי שהודגם, הורידו את הלחץ של כל הכניסות ל-20 מיליברס, ואת לחץ היציאה לאפס מיליברים.
ודא שקצבי הזרימה בכניסות שווים בערך. בעת שינוי המאגר, הגדר את כל לחצי הכניסה ל -12 מיליברס ולחץ היציאה ל -5 מיליברס. כדי להזריק במהירות תמיסה, הגדר את הלחץ של הכניסה המתאימה ל-150 מיליברס, והתאם את הלחץ בכניסות האחרות לכ-100 מיליברס, כך שקצב הזרימה המתקבל בכניסות הוא 500 ננוליטרים לדקה.
כדי לשנות את הפתרון, מלאו 200 עד 300 מיקרוליטרים של התמיסה בצינור מאגר חדש והגדירו את הלחץ להגדרת השינוי. לאחר מכן, פתח את צינור המאגר של המפרצון. לאחר שנוצרה טיפה קטנה בקצה הצינור, הברג את הצינור החדש עם הפתרון הטרי, שנה את הגדרת הלחץ לזרימה גבוהה.
בהתאם לתצורה המיקרופלואידית ולגיאומטריה של התא, המתן שלוש עד חמש דקות עד שהתמיסה תמלא את הצינורות ותגיע לתא. ניתן לעקוב אחר התהליך על ידי מדידת העלייה בפלואורסצנציה לאורך זמן. לצורך פונקציונליזציה של פני השטח, החליפו את התמיסה 3 עד 200 מיקרוליטרים של 50 זרעי ספקטרין-אקטין פיקומולריים ב-F-buffer, והזיקו את התמיסה למשך שתי דקות עם זרימה גבוהה שלוש.
עבור מעבר פני השטח, החלף צינור שלוש עם 300 מיקרוליטרים של 5% BSA ב- F-buffer, ולאחר מכן, הזריק במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש, ואחריו חמש דקות באמצע זרימה שלוש, עם לחץ מופחת של שבעה עד שמונה מיליברס בתעלות אחת ושתיים כדי לקבל זרימה נגדית של 100 ננוליטרים לדקה. כל משטח התא יהיה BSA passivated. החלף את הצינור שלוש ל- F-buffer כדי לשטוף את התעלה במשך חמש דקות בזרימה גבוהה שלוש.
מאוחר יותר, החליפו את הצינורות אחד לשלושה עם פרופילין אקטין מיקרומולרי אחד, אקטין מיקרומולרי 0.15 ומאגר F, בהתאמה, כפי שמוסבר בכתב היד, והזריקו תמיסות מוכנות טריות באמצעות הזרימה הגבוהה, כולן מוגדרות מראש במשך שלוש עד ארבע דקות. הפעילו את המיקרוסקופ והתאימו את זמן החשיפה של המצלמה ל-100 עד 200 אלפיות השנייה, לייזר עירור ל-10 עד 20% הספק, וסך הכל פלואורסצנציה פנימית של השתקפות פנימית, או עומק TIRF, ב-200 עד 300 ננומטר כדי לצלם את התמונות עם מטרה של פי 60. לאחר מכן, הגדר את הגדרת הלחץ לאמצע זרימה אחת למשך 10 דקות כדי לרשום את פילמור החוטים בקצב של מסגרת אחת כל 20 שניות, ולאחר מכן את זרימת הביניים שתיים למשך 15 דקות להזדקנות נימה.
לכידת דה-פולימריזציה במצב אפיפלואורסצנציה בפריים אחד כל חמש שניות, לאחר פעימה אחת עד שתיים, עבור לזרימה האמצעית שלוש כדי לרשום נימים מתפרקים בסביבות 10 תת-יחידות בשנייה. כדי לאפס את הניסוי, שברו את כל החוטים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי חשיפה רציפה שלהם ללייזר בעוצמה מקסימלית למשך שתי דקות. בדקו תנאים שונים על ידי שינוי תמיסות אחת, שתיים או שלוש והזרקתן בזרימה גבוהה במשך שלוש עד ארבע דקות.
התוצאה של ניסוי הפילמור/דה-פולימריזציה הבסיסי מוצגת כאן. הקימוגרפים שהתקבלו שימשו לכימות שיעורי הפילמור והדה-פולימריזציה. כאשר חוטי האקטין הגדלים נחשפו לתמיסת קופילין המסומנת באופן פלואורסצנטי, צבירי הקופילין נוקו וצמחו לעבר הקצוות המחודדים והתוחמים.
כאשר חוטים בודדים נחשפים לקסין הם יוצרים צרורות שנראים בהירים יותר ולא מיושרים בצורה מושלמת עם הזרימה. חשוב מאוד להימנע מהכנסת בועות אוויר במערכת בעת החלפת צינורות ולשים לב לא לקבל צינורות מאגר ריקים. טכניקה זו הייתה קריטית להפעלת כוחות משיכה על פני עשרות חוטים בודדים, התבוננות ברגישות מכנית של פורמין וקופילין, והתפרקות ARP2/3.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקולים המשלבים מיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם מיקרופלואידיקה לצורך ניטור של סיבי actin בודדים בזמן אמת. גישה זו מאפשרת חשיפה רצפית של הסיבים לתמיסות חלבונים שונות, ובכך מקלה על חקרם של חלבונים נקשרי actin.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביופיזיקה
רקע
- סיבי אקטין ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים.
- הבנת הדינמיקה של האקטין חיונית להשגת תובנות לגבי תפקודים ביולוגיים שונים.
- מיקרופלואידיקה מאפשרת בקרה מדויקת על התנאים הניסויים.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות מולקולריות.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד חלבונים קושרי-אקטין מווסתים את הרכבתם ופירוקם של סיבי אקטין.
- לכמת תגובות המתרחשות על מספר סיבי אקטין בו-זמנית.
- לשלוט בתנאים ביוכימיים ומכניים במהלך הניסויים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשילוב עם מיקרופלואידיקה.
- חשיפה רצפית של סיבי אקטין לתמיסות חלבון שונות.
- הכנת תאי PDMS לבדיקות מיקרופלואידיות.
- ניטור בזמן אמת של דינמיקת סיבי אקטין.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של סיבי אקטין בודדים תחת תנאים משתנים.
- כימות של השפעותיהם של חלבוני קישור לאקטין שונים.
- הדגמה של התועלת שבשימוש במיקרופלואידיקה לחקר דינמיקת אקטין.
- תובנות לגבי המנגנונים של ויסות סיבי אקטין.
מסקנות
- השילוב של מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה יעיל לחקר סיבי אקטין.
- גישה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי הבקרה של דינמיקת האקטין.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטות אלו כדי לבחון אינטראקציות בין חלבונים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של הרכבה ופירוק של סיבי actin תחת תנאים מיקרופלואידיים מבוקרים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף של מטרות. גישה זו מספקת נתונים ברזולוציה גבוהה ובזמן אמת על אינטראקציות בין חלבונים, מה שתומך בביטחון חיזוי באסטרטגיות של מודולציה של השלד התאי. שילוב של מיקרופלואידקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית מקדם את היכולת של תיק הפיתוח לחקור את התפקוד של חלבונים נקשרי-actin בדיוק ובשחזוריות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תצפית ישירה על השפעותיהם של חלבוני קישור לאקטין על דינמיקת הסיבים ברזולוציה של סיב בודד.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד משתנים ביוכימיים ומכניים בזמן אמת.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידה כמותית של קצבי פולימריזציה ודפולימריזציה.
- מספק פלטפורמה לחקירה מונחית-השערה של מסלולי בקרה של השלד התאי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק תנאים סטנדרטיים וניתנים לשחזור להערכת השפעות של תרכובות או חלבונים על דינמיקת אקטין.
- מפיק פלטים כמותיים, כגון קימוגרפים (kymographs), לצורך השוואה מהימנה בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה המשכית של מודולטורים של אקטין.
- מאפשר החלפה מהירה של תמיסות ובדיקות רב-ערוציות (multiplexed) בתוך תא מיקרופלואידי יחיד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את דינמיקת האקטין in vitro לתהליכים של השלד התאי הרלוונטיים למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי מודלים במורד הזרם.
- מספקת רצף מהמנגנון המולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של חומרים המטרים אקטין.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הבהרת תפקוד החלבון וספציפיות האינטראקציה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו של מיקרוסקופיית פלואורסצנציה מבוססת מיקרופלואידיקה מתאימה לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת בדיקה מדויקת של היפותזות והבהרת מסלולים עבור מטרות המווסתות את האקטין.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את הרכבת ופירוק סיבי אקטין בתגובה לחשיפה לחלבונים מוגדרים, ובכך מספק תובנה מכניסטית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת מודולטורים של חלבונים קושרים לאקטין.
- אנליטיקה: מפיק קימוגרפים ומדידות קצב להשוואה סטטיסטית חסונה של משתנים ניסויים.
- מחקר תרגומי: מניח את התשתית לקישור בין מנגנון מולקולרי לבין פנוטיפים של שלד התא הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית וסתגלנית לבדיקה חוזרת של חלבונים מגוונים המווסתים אקטין.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי תרופות המכוונות לאקטין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תנאי הניסוי ומאפשרת איסוף נתונים הניתן לשחזור ובעל תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי הבהרת המעורבות והתפקוד של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדירת עדיפויות מותאמת סיכון של מועמדים למודולציה של אקטין לצורך קידומם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהקמת מערכות מיקרופלואידיקה ובתפעול מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נדרש גישה למערכות מיקרופלואידיקה מבוססות בקרה בלחץ ולפלטפורמות דימוי ברזולוציה גבוהה.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין הצוותים השונים בהכנת התמיסות ובפרמטרי הזרימה.
- התאמה לחלבונים שונים קושרי-אקטין או למערכות מודל עשויים לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- הקפדה על דגשים טכניים, כגון מניעת בועות אוויר והכנת התא, היא קריטית לצורך שחזור התוצאות.
שאלות נפוצות בביופרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Polydimethylsiloxane (PDMS) Chamber Assembly
1:45
Connect Microfluidic Device
3:11
Configuring the Setup with Standard Flow Rates and Changing Solution
4:21
Basic Single Filament Experiment: Adenosine Diphosphate (ADP)-Actin Barbed End Depolymerization
6:45
Results: Polymerization of Actin Filaments from Spectrin-Actin Seeds when Exposed to Different Actin Binding Proteins
7:24
Conclusion
