ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca^{2 +} טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים

גישה זו מזהה שינויים בתפקוד התכווצות במהלך התפתחות אי ספיקת לב. התגובה התפקודית במיוציטים לנוירוהורמונים ולסוכנים טיפוליים פוטנציאליים יכולה גם להיות מוקרנת. מיקום המיוציטים עשוי לקחת תרגול אך הוא חיוני בהשגת הדמיה עקבית באורך סרקומר.

המדגימה את ההליך היא מרגרט ווסטפול, פרופסור חבר והחוקרת הראשית של המעבדה. לפני תחילת הניסוי, לחמם מראש חבילת ג'ל מדיה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מפעילים את רכיבי פלטפורמת הפונקציה המכווצת כפי שמוזכר בכתב היד ומרכיבים צינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית.

לאחר מכן, העבר את חבילת הג'ל שחוממה מראש למחזיק הצינור והפעל את הוואקום בעוצמה למגרה התא. הניחו צינור של 50 מיליליטר עם מדיה במחזיק הצינור המבודד כדי להתחיל זלוף במהירות של 0.5 מיליליטר לדקה דרך צינורות המשאבה הפריסטלטיים. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מדיה שחוממה מראש לסירת שקילה קטנה והעבירו תלוש כיסוי אחד המכיל מיוציטים מתא הגירוי לסירת השקילה.

החזירו את תא הגירוי לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. הסר את מחליק הכיסוי מסירת השקילה ונגב בעדינות את החלק התחתון לפני העברתו לתא כיסוי משומן טרי והוספת טיפת מדיה על תלוש הכיסוי. הניחו תושבת אלקטרודת פלטינה מעל משטח הכיסוי, ולאחר מכן הניחו כיסוי חדש מעל החלק העליון עם מלקחיים והניחו תושבת עליונה מעל כריך החלקת הכיסוי.

התקן שניים או ארבעה ברגי panhead מספר אפס כדי לסיים את הרכבת התא. במשאבה הפריסטלטית כאשר המדיה נוכחת לאורך כל הצינורות, חברו את הצינורות למחמם המקדים ואת הקדם-מחמם לתא ההחלקה של הכיסוי. לאחר מכן, התחל זלוף ב 0.5 מיליליטר לדקה והניח מגבון רקמות מתחת לתא כדי להבטיח שאין דליפות.

לאחר הצבת תא ההחלקה של הכיסוי במתאם הבמה של המיקרוסקופ, הפעל את מערכת החימום ושקול את המכלול למשך חמש עד 10 דקות כדי להשיג טמפרטורת מדיה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במרכז התא. שימו לב למדיה המחורבנת שנאספת בקצה הנגדי של התא עם צינורות המחוברים למערכת ואקום. במהלך זמן שיווי המשקל, דמיינו מיוציטים עם מטרת טבילת המים פי 40 במיקרוסקופ.

כדי להפעיל את מגרה הקצב, הגדר את המתח ל -35 עד 40 וולט והתאם את תדר הגירוי ל -0.2 הרץ כדי לייעל את תפקוד ההתכווצות ואת הישרדות המיוציטים. כדי לאסוף עקבות קיצור sarcomere, לפתוח את התוכנה במחשב ובחר בסדר, קובץ וכרטיסיות חדשות. הכן תבנית מסך על-ידי בחירת מעקבים, עריכת מגבלות משתמש ואורך סרקומר.

הקליטו עקבות באורך סרקומר עם הקובץ וכרטיסיות חדשות, זיהו מיוציט מתכווץ ומקמו את המיוציט לאורך ציר האורך של המצלמה כך שתבנית הסטריאציה תהיה אנכית. השתמש בעכבר המחשב כדי למקם את אזור העניין או את תיבת החזר ההשקעה מעל המיוציט. בחר אסוף והתחל להקליט פונקציית חוזה.

קיצור שיא למשך 60 שניות מכל מיוציט בתדרי גירוי נמוכים של 0.5 הרץ. שיא הקיצור של סרקומר מחמישה לעשרה תאים לכל תלוש. כדי למדוד את הקיצור בטווח התדרים, מקם את המיוציטים בכל תדר כדי לקבל קיצור מצב יציב לפני ההקלטה.

הכפילו את קצב הזליפה והתחילו להקליט 15 עד 20 שניות לאחר הגירוי בתדר חדש בטווח של 0.2 עד שני הרץ ותרשמו לא יותר משני מיוציטים לכל כיסוי החלקה לקיצור בטווח הנתון של תדרי הגירוי. רשום לפחות שבע התכווצויות לכל תא כדי לקבל נתונים ממוצעים אמינים של אותות. בחר את הקובץ, בחר מעקב מוקלט ולאחר מכן בחר פתח.

בחר טאב אחד ממעקב הבסיס ולאחר מכן הגדר את החלונית הצהובה בחלק העליון של העקיבה כדי לקבל אורך קשת. הכן תבנית ניתוח עם אפשרויות ניתוח ארעיות מונוטוניות וסימן אירוע TTL בהגדרה של תיבת T Zero באפשרויות הדרושות מהתפריט. שמור אפשרויות ניתוח אלה על-ידי בחירת תבניות ושמירת תבנית ניתוח באמצעות מזהה.

טען את תבנית הניתוח לפני ניתוח כל מעקב. כדי לנתח את הנתונים, בחר סימנים, שער, הוסף ארעי ולאחר מכן המר מסימן אירוע וטווח ניתוח. הגדר את טווח הזמן ממינוס 0.01 עד 1.20 שניות עבור מיוציטים בקצב של 0.2 הרץ.

בחר טווח זמן קצר יותר עבור מיוציטים מגורה בתדרים גבוהים יותר. בחר פעולות ואירועים ממוצעים כדי להפיק הקלטה ממוצעת של אות מתחת למעקב הבסיס המקורי. לאחר מכן, בחר טאב אחד מהמעקב הממוצע של האות ולאחר מכן עבור לסימנים בתפריט העליון ואחריו הוסף ארעי, בחר פעולות וניתוח ארעי מונוטוני כדי להציג את ערכי ממוצע האות עבור פרמטרים בסיסיים של sarcomere בלוח התצוגה הממוצע של האות.

בחר ייצוא ניתוח ארעי מונוטוני וזרם לוח והעבר ניתוח סרקומר חולף לגיליון אלקטרוני לניתוח מרוכב של מיוציטים מרובים. כדי להעתיק את המעקב הממוצע של האות, בחר ייצוא, מעקב נוכחי, ולאחר מכן כרטיסיות לוח ואפשרויות לפי הסדר והגדר את המקומות העשרוניים לחמישה. בחר מפריד טאבים ולחץ על אישור.

קצב האות ממוצע עקבות עבור כל הקלטת מיוציטים לגיליון אלקטרוני שני. המחקר הראה כי עומס הלחץ או PO, הפחית את תפקוד התכווצות של המיוציטים בהשוואה לקבוצת הבושה. עם זאת, ארבעה ימים לאחר העברת הגן של טרופונין לב IT 144D או cTnIT144D, יכולת ההתכווצות במיוציטים של PO חזרה לכיוון רמות הבושה, מה שמצביע על כך שניתן לשחזר את תפקוד המיוציטים.

במחקרים הראשוניים, העברת גנים של cTnIT144D שיפרה את קיצור השיא ואת רמות הסידן הדיאסטולי הגבוהות בהשוואה ל-CTnI. התאמות עדינות במיקום של myocyte הלב נדרשים לעתים קרובות כדי להשיג עקבות קיצור ברור. פרוטוקול זה יכול להתבצע גם על מיוציטים לבביים עמוסים בצבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן כגון Fura-2 AM כדי לזהות טרנזיינטים של סידן בנוסף לקיצור.