בידוד צואה מורין והשתלת מיקרוביוטה

כאן תיארנו פרוטוקול שמדריך אחרים בחקירת המנגנונים של דיסביוזיס במחלות, החל מאיסוף דגימות צואה ועד לשימוש בשיטת הרול השוויצרית לחקר שינויים במעיים. כדי להתחיל, לרסס את החזה ואת הצדדים של העכבר המתת חסד עם 70% אתנול, בזהירות לפתוח את העור ואת חלל הצפק כדי לחשוף את מערכת העיכול. בודדו את הצקום, והשתמשו במספריים כירורגיים סטריליים כדי לחתוך אותו לשניים.

לחשוף בקצרה את cecum, לחתוך 0.5 ס"מ קרוב מן ileum ו 0.5 ס"מ distally בצומת שלה עם המעי הגס. מעבירים את הצקום המבודד לצלחת פטרי סטרילית. השתמש במרית סטרילית כדי להעביר את התוכן cecal לתוך צינורות סטריליים, ולאחסן את aliquots במקפיא 80 מעלות צלזיוס.

יש להשהות מחדש כדורי צואה טריים או קפואים במי מלח סטריליים בפרופורציה של 1 עד 20, ולערבל עד לקבלת הומוגניזציה. מעבירים את ההומוגנט דרך מסנן ניילון של 30 מיקרומטר נקבוביות כדי להסיר חומר חלקיקי גדול. צנטריפוגה ב-79G למשך חמש דקות, ולאסוף את הסופרנאטנט לשימוש להשתלה.

גבאג' אוראלי 100 מיקרוליטר של הבוצה לכל עכבר מושתל ללא חיידקים במשך שלושה ימים רצופים, ולאחר מכן gavage כל שלושה ימים במשך שבועיים. הניחו את העכבר בעדינות במעצורים על מחזיק העכבר שחומם מראש, והשאירו את הזנב בחוץ. בזהירות קלט למטה את החלק העליון מבלי לצבוט אותו כדי לא להלחיץ את העכבר.

אפשר לעכבר לנוח במחזיק, והנח אותו על פלטפורמת מכונת שרוול הזנב למשך שלוש עד חמש דקות, מכוסה בסדין כדי להתאקלם. אספו לפחות שלושה סבבים של מדידות לחץ סיסטולי באמצעות פלטיסמוגרפיה של שרוול הזנב, וערכו ממוצע של המדידות מכל הסבבים עבור לחץ סיסטולי ממוצע עבור כל חיה. אספו באופן אספטי תוכן צקלי מהעכבר שעבר המתת חסד.

כדי לקצור את המעיים ורקמות אחרות, אתרו את הרקמה בעכבר ובלו אותם במספריים כדי לבחון את תפקיד המיקרוביוטה של המעי בבריאות הלב והמטבוליזם. ביום הראשון, נתחו את מעי העכבר מהצד האנאלי לצד הבטן. ומניחים את כל מערכת העיכול המבודדת בצלוחית פטרי המכילה PBS.

משכו בעדינות את הקצה הפרוקסימלי מקצה הקיבה, והוציאו ביד את השומן שמסביב ואת רקמת החיבור. בודדו את המעי הדק, ובצעו זיגזג מסוג Z בכל אורך. לאחר מכן, לחתוך כדי להשיג את התריסריון, jejunum, ו ileum.

בודד את המעי הגס על ידי חיתוך החלק של המעי מתחת cecum. חותכים את התריסריון, jejunum, ileum, ואת המעי הגס. השתמש מזרק ומחט עם קצה כדור בזהירות לשטוף ולשטוף את המעיים פנימה עם PBS מבלי לקרוע את המעי.

הניחו את הבטן על נייר פילטר, ותייגו את הנייר בשם המקטע ולאחר מכן P בפינה השמאלית העליונה עבור פרוקסימלי או D עבור דיסטלי בפינה השמאלית התחתונה. חותכים את המעיים לאורכם עם מספריים בקצה הכדור. פתחו את המעיים על נייר הפילטר, ושטפו עם PBS נוסף לפי הצורך.

דחפו את המעיים בין שני ניירות פילטר, והדקו את ניירות הסינון בארבע נקודות או פינות ליד המעיים. יש להשרות בתמיסת חיץ ניטרלית פורמלין 10%, ולנער באמצעות נדנדת פלטפורמה בחמישה סל"ד למשך הלילה בטמפרטורת החדר. ביום השני, מחממים את האגרוז המוכן 2% במים מזוקקים עם מוט ערבוב בכוס מכוסה ברדיד אלומיניום.

כדי לאחזר את הרקמות, הפשיט את נייר הסינון העליון, וגלגל את המעיים מהצד הפרוקסימלי כך שהצד הפרוקסימלי ייכנס פנימה ראשון, וגלגל פנימה כך שלומן יהיה בפנים גם במגלשה. הצמד עם מחט של 30 מד או שתיים לפי הצורך. שאפו מיליליטר אחד של אגרוז באמצעות פיפטות חד פעמיות להעברת בוגרים, ושפכו את האגרוז על קטע מעיים מגולגל על משטח שטוח תוך הימנעות מבועות אוויר ברקמות.

לאחר שהאגרוז מתקרר ומתמצק, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את האגרוז הנוסף סביב חלק הרקמה. לבסוף, הניחו את חלקי המעיים בעיבוד רקמות או בהטמעת קלטות, והשרו אותם באתנול 70% בארבע מעלות צלזיוס. הערכת המגוון הביולוגי של המינים בתכולת הצק"ל המתקבלת מעכברים בדיאטות מלח רגילות ובדיאטות עתירות מלח מוצגת כאן.

שינויים במיקרוביוטה של המעי בתגובה למלח הגבוה כללו ירידה במגוון הביולוגי של חיידקים. קנה מידה רב-ממדי לא מטרי מראה שהחיידקים מעכברי מלח רגילים ועכברים בעלי תזונה עתירת מלח יוצרים אשכולות נפרדים. מלח גבוה קשור ליחס מוגבר בין Firmicutes ל-Bacteroidetes.

השתלת מיקרוביוטה בצואה מעכברים הניזונים ממלח גבוה גורמת לעכברים נטולי חיידקים ליתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II. העברת מיקרוביוטת מעיים דיסביוטית עתירת מלח הייתה קשורה לעלייה משמעותית בלחץ הסיסטולי בעכברים נטולי חיידקים בהשוואה לעכברים שקיבלו מיקרוביוטה רגילה של מעי מלח. התמונות המייצגות מראות כתם אפוליפופרוטאין A-I באיליה המתקבל מעכברים שסבלו מהיפרליפידמיה ללא או עם פרוטאינוריה.

פרוטוקול זה מתאים את הצעדים להשגת FMT מוצלח בשיקולי ניסוי מרכזיים הן עבור תורמי אדם והן עבור תורמי מכרסמים.