פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)
7 בספטמבר 2022
זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. פרוטוקול זה שימושי לניקוי זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים כדי לבחון את המבנה העוברי העדין יותר.
שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים למצוא במהירות וללא מאמץ תקופות חריגות של התפתחות עוברי עגבניות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא טיפול בזרעי עגבניות עם hypochlorite נתרן אשר מספק בסיס לתצפית של עוברי עגבניות. התחל עם הכנה כימית וקציר של פירות Solanum lycopersicum שלושה עד 23 ימים לאחר הפריחה או DAF.
מיד מניחים את הפירות על הקרח ומחלקים אותם לפירות מוקדמים, אמצעיים ומאוחרים, על סמך הימים שלאחר הפריחה. שוברים את הפרי המוקדם, מניחים אותו על שקופית ואוספים זרעים טריים בזהירות עם מלקחיים מדויקים בהגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו. לפירות בינוניים ומאוחרים, שוברים את הפרי ואוספים ישירות זרעים טריים באמצעות מלקחיים מדויקים.
בשיטה המקובלת, מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מיד לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר FAA מקובע ומניחים את הצינור על השייקר האורביטלי ב-5 סל"ד למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ייבשו את הזרעים ב-70%95% ו-100% אתנול למשך שעה כל אחד על שייקר אורביטלי ב-5 סל"ד. לאחר שתסיימו, הניחו את הזרע בשלוש עד חמש טיפות של תמיסת הניקוי הקיימת על המגלשה, וכסו אותו בעדינות במחליק כיסוי.
השתמש בשקופית קעורה אחת עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים. בהתאם לשלבי ההתפתחות של הזרעים, לדגור אותם בטמפרטורת החדר לסליקה. לאחר הדגירה, התבונן בדגימות עם ניגוד הפרעות דיפרנציאלי, או מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית בהגדלה של 10x, 20x ו- 40x.
התאם ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח צמצם המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד תמונות. מעבירים את הזרעים הטריים שנאספו מהפירות השבורים לצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של תמיסת חיטוי. דגרו את הדגימות על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך שלוש עד 50 דקות בטמפרטורת החדר.
ברגע שקווי המתאר הפנימיים ביותר של ציפוי הזרעים נראים בבירור, השליכו את תמיסת החיטוי. עבור זרעים אמצעיים ומאוחרים, העבירו את הזרעים לשקופית. השתמש במלקחיים ובמחט חיתוך כדי להסיר את ריר הזרע תחת הגדלה של פי 1 עד 4 ממיקרוסקופ הסטריאו.
מעבירים את הזרעים בחזרה לצינור הצנטריפוגה המקורי באמצעות מלקחיים. לשטוף אותם חמש פעמים ב 1.5 מיליליטר של מים deionized במשך 10 שניות כל אחד, ולהשליך את המים deionized. לאחר מכן, הוסף את הנפח הכפול של פתרון הניקוי לזרעים.
בהתאם לשלב הזרעים, תן את הטיפול ואקום לסירוגין במשך אפס עד 50 דקות, עם מרווחים של 10 דקות לאחר כל טיפול ואקום של 10 דקות. לאחר טיפול ואקום, החלף את תמיסת הסליקה. כדי להקל על ניקוי הזרעים, מניחים את צינור הצנטריפוגה מוגן מפני אור למשך 30 דקות עד שבעה ימים בטמפרטורת החדר.
במקרה של עוברים מאוחרים, להחליף את הפתרון מדי יום עם פתרון ניקוי טרי, ולאחר מכן הכפפת הזרעים לטיפול ואקום במשך 10 דקות. הניחו את הזרעים המסולקים על השקופית או על שקופית קעורה בודדת. באמצעות מיקרוסקופ DIC המצויד במצלמה דיגיטלית, כוונן ומטב את בהירות האור המועברת, מחוון DIC ומפתח המעבה בזמן אמת עבור כל דגימה ולכוד את התמונה.
בשיטה הקונבנציונלית של ניקוי זרעי S.lycopersicum, תאי האנדוספרם הצפופים חסמו את ההדמיה של עוברים מוקדמים ב 3 ו 6 DAF. החדירות המופחתת במהלך צמיחת הזרעים הביאה לתמונות מטושטשות לאחר 9 DAF. רירית הזרעים וציפוי הזרעים נעשו בהדרגה צפופים יותר, מה שמנע חדירה של חומרי ניקוי מ-13 DAF ואילך.
קווי המתאר של העובר בתוך 14 עד 19 זרעי DAF היו מטושטשים ביותר, למרות זמן הטיפול הממושך של שבעה ימים. המבנה הפנימי ב-22 זרעי DAF היה בלתי נראה לחלוטין. רירית ציפוי הזרעים המופשטת שיוצרה על ידי תאי האפידרמיס של ציפוי הזרעים בלטה מ-13 DAF ואילך.
הטיפול בנתרן היפוכלוריט איפשר זיהוי ברור של ציפוי הזרע הפנימי וניתוק של רוב הרירית הדביקה ללא נזק לזרעים. בפרוטוקול הסליקה הממוטב הראו הזרעים שקיפות משביעת רצון בכל שלבי ההתפתחות שנבדקו. נצפו שכבות התאים המובהקות של שכבת הזרע ב-3 DAF, תאי אנדוספרם הניתנים להבחנה ב-5 DAF, העובר בצורת מקל ב-7 DAF, השלב הגלובולרי ב-9 DAF ושלב הלב ב-11 DAF.
בפרוטוקול האופטימלי, מידת התלתל של קוטילדונים ולירות מריסטם אפיקלי נלכדה בקלות רבה בשלבים שונים של התפתחות עוברית. סטריליזציה מסירה רירית זרעים ופיגמנט ציפוי זרעים, המשפרים את החדירה וההדמיה של הזרעים. טיפול ואקום יכול להאיץ את חדירת פתרון הסליקה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
זרע העגבנייה משמש כמודל מכריע לחקירת גנטיקה וביולוגיה התפתחותית ברבייה של צמחים. פרוטוקול זה מאפשר ביצוע הבהרה (clearing) של זרעי עגבנייה בשלבים התפתחותיים שונים כדי לבחון את המבנה העוברי המורכב.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
- רבייה של צמחים
רקע
- זרעי עגבנייה חיוניים לחקר ההתפתחות העוברית של צמחים.
- הבנת שלבי התפתחות העובר בעגבנייה יכולה לחשוף תובנות גנטיות.
- טכניקות הבהרה משפרות את הוויזואליזציה של מבנים עובריים.
- טיפול בנתרן היפוכלוריט הוא מפתח לצפייה בעוברים.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול להבהרה של זרעי עגבנייה.
- הקלה על תצפית בעוברים של עגבנייה בשלבי התפתחות שונים.
- סיוע לחוקרים בזיהוי תקופות של התפתחות עוברים לא תקינה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר פירות *Solanum lycopersicum* בטווח של 3 עד 23 ימים לאחר הפריחה.
- חלוקת הפירות לקטגוריות מוקדמת, אמצעית ומאוחרת בהתבסס על ימי הפריחה.
- שימוש בפינצטה מדויקת לאיסוף זרעים טריים תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי.
- טיפול בזרעים בנתרן היפוכלוריט לשיפור התצפית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר ויזואליזציה ברורה של עוברים בעגבנייה.
- חוקרים יכולים לזהות ביעילות חריגות התפתחותיות.
- ניתן להבחין בבירור בשלבים שונים של התפתחות העובר.
- השיטה היא פשוטה ויעילה למחקרי עוברים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מהווה כלי בעל ערך למחקר בביולוגיה התפתחותית של צמחים.
- הוא משפר את ההבנה של embryogenesis בזרעי עגבנייה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לחקור וריאציות גנטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה יעילה של עוברי זרעי עגבנייה פותרת צוואר בקבוק מרכזי בביולוגיה של התפתחות צמחים ובגילוי תכונות. פרוטוקול שקיפות זה מאפשר הערכה כמותית ברזולוציה גבוהה של שלבי התפתחות הזרעים, ובכך תומך במחקר מונחה-השערות ובסריקה גנטית במסלולי שיפור גידולים חקלאים. המשכיות משופרת של הדימוגים לאורך חלונות ההתפתחות מחזקת את רמת הביטחון החזויה עבור מו"פ תרגומני בצמחים ותיקוף תכונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה מורפולוגית מדויקת של שלבים עובריים לצורך תיקוף של מטרות גנטיות.
- מסייע בזיהוי של הפרעות התפתחותיות בקווי מוטנטים לצורך חקירת מסלולים ביולוגיים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת נקודות בקרה התפתחותיות ביצירת זרעים.
סריקה ופיתוח מערך בדיקה
- מספק פרוטוקול סטנדרטי להכנת זרעים שקופים המתאימים לבדיקות דימוי כמותיות.
- משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) בבדיקה פנוטיפית של תכונות זרעים.
- מאפשר השוואה מהימנה של פנוטיפים התפתחותיים בין גנוטיפים וטיפולים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- סנכרון של תוצרי דימוי התפתחותיים עם בחירת תכונות תרגומיות בגידולי R&D.
- תומך ברציפות מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף טרום-רבייה במיני משפחת הסולנאקיים (Solanaceae).
- מפחית את הסיכון לכישלון של תכונות בשלב מאוחר על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של פגמים התפתחותיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף מהגילוי ועד לאימות במחקר ופיתוח של תכונות צמחים, החל מבדיקה מוקדמת של השערות גנטיות, דרך סריקה פנוטיפית ועד לקידום תכונות תרגומיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של מבנים עובריים.
- סריקה: מספקת זרעים שקופים, ניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור דימות כמותי והשוואת פנוטיפים.
- אנליטיקה: מספקת תוצאי מורפולוגיה ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח סטטיסטי של התקדמות התפתחותית.
- מחקר תרגומי: מסייעת להלימה של תכונות וקידום מותאם סיכון בתוכניות לשיפור יבולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה לשקיפות בעלת יישום רחב עבור Solanaceae ומינים קרובים בתיקי עבודות של מו"פ בצמחים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת תכונות ובתיקוף מטרות על ידי פתרון עמימות התפתחותית.
- ערך תפעולי: מייעל את הכנת הדגימות, משפר את השחזוריות ומפחית את עצימות העבודה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) וקידום תכונות ביעילות הונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של קווים גנטיים ותכונות התפתחותיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה התפתחותית של צמחים ובמיקרוסקופיה.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית DIC ולתשתיות לטיפול בוואקום.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך אימוץ הפרוטוקול והשוואת נתונים.
- ניתן להתאים למינים אחרים של Solanaceae באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- יעילות ההבהרה עשויה להשתנות בהתאם לעובי מעטפת הזרע ולשלב ההתפתחותי.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:30
Seed Collection
1:10
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using a Conventional Protocol
2:21
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using the Optimized Protocol
4:11
Results: Clearing Tomato (Solanum lycopersicum) Seeds at Different Developmental Stages to Observe the Finer Embryonic Structure
5:56
Conclusion
