פיתוח מהיר של מעגלי זיהוי מצב התא עם Poly-Transfection

הפרוטוקול שלנו מאפשר להבין בקלות ובמהירות את היחסים בין חלקים ביולוגיים. אנו יכולים לבחון את ההתנהגות של שילובים מטריים רבים של חלקים בבאר אחת. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לאפיין את היחסים המורכבים בין רכיבי המעגל באופן מקיף יותר עם יעילות ניסויית גבוהה יותר מאשר גישות קונבנציונליות.

שיטה זו ישימה לביולוגיה סינתטית ולכל שאלה ביולוגית, חקירת שינויים התנהגותיים בתא בתגובה לרמות שונות של גנים נגועים שבהם ניתן למדוד את התפוקה באמצעות ציטומטריית זרימה. התחל להכין צינורות עבור כל צבר DNA על ידי הקצאת צינורות מיקרו צנטריפוגות 1.5 מיליליטר המסומנים ללא בקרת צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת ירוק ניאון, כל בקרת צבע, תערובת פולי-טרנספקציה אחת ומיקס פולי-טרנספקציה שתיים. הוסף 36 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לבקרת ללא צבע, בקרת mKO2, בקרת TagBFP, בקרת ירוק ניאון וכל צינורות בקרת הצבע, ולאחר מכן הוסף 18 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל פולי-טרנספקציה מערבב אחד ופולי-טרנספקציה מערבבים שני צינורות.

לאחר מכן, הוסף 600 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה ללא צבע, 300 ננוגרם של mKO2 ו -300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע mKO2 והוסף 300 ננוגרם של TagBFP ו -300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור בקרת הצבע TagBFP. לצינור בקרת הצבע הירוק ניאון, הוסף 300 ננוגרם של ירוק ניאון מכונן ו- 300 ננוגרם של פלסמיד מילוי, ולאחר מכן הוסף 100 ננוגרם של כל mKO2, TagBFP, ירוק ניאון מכונן ו- 300 ננוגרם של פלסמיד מילוי לצינור הבקרה של כל הצבעים. לתערובת פולי-טרנספקציה צינור אחד, הוסף 150 ננוגרם של mKO2, 75 ננוגרם של פלסמיד ירוק ניאון כתב ו 75 ננוגרם של פלסמיד מילוי.

לתערובת הפולי-טרנספקציה יש להוסיף 150 ננוגרם של TagBFP, 75 ננוגרם של פלסמיד L7Ae ו-75 ננוגרם של פלסמיד מילוי. לאחר שתסיים, צור את תערובת האב של טרנספקציה בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על ידי שילוב של 216 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם 9.48 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה לפני שמניחים אותו בצד.

הוסף 1.58 מיקרוליטר של מגיב משפר ללא בקרת צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע והוסף 79 מיקרוליטר של מגיב משפר לכל צינורות תערובת פולי-טרנספקציה. מערבבים כל צינור בנפרד על ידי פיפטינג נמרץ. הוסף 37.58 מיקרוליטר של תערובת מאסטר transfection לבקרת ללא צבע, בקרת צבע יחידה וכל צינורות בקרת הצבע וערבב על ידי pipeting נמרצות.

לאחר מכן, להוסיף 18.79 מיקרוליטר של תערובת מאסטר transfection לכל צינורות תערובת transfection פולי ולערבב כל צינור היטב עם pipetting נמרץ. מוציאים את תערובות הטרנספקציה לתוך הבארות על ידי פיפטינג 65.97 מיקרוליטר של כל תערובת טרנספקציה עבור ללא צבע, צבע יחיד וכל פקדי הצבע לתוך הבארות המתאימות, ולאחר מכן להעביר 32.98 מיקרוליטר של תערובת פולי-טרנספקציה אחד לתוך באר poly-transfection ולהפיץ את הקומפלקסים ביעילות על ידי ערבול הצלחת במהירות אך בעדינות הדוק, פיגור תבנית לאורך משטח שטוח, ואז פיפטה 32.98 מיקרוליטר של פולי-טרנספקציה מערבבים שניים לאותה באר פולי-טרנספקציה ומערבלים את הצלחת באותה צורה. לדגור על תאים במשך יומיים.

בצע ציטומטריית זרימה כדי לקרוא את הפלואורסצנטיות של סמני הטרנספקציה ומדווח הפלט עבור כל תא. טרנספקציה משותפת המבוצעת היטב, שונה מהפולי-טרנספקציה המוצגת בסרטון, מראה מתאם הדוק בין TagBFP ו- EYFP, המבטא פלסמידים שנמסרו במשותף. לעומת זאת, קו-טרנספקציה שבוצעה בצורה גרועה מראה מתאם גרוע בין שני הפלסמידים.

פולי-טרנספקציה שבוצעה היטב הראתה כיסוי טוב של המרחב הדו-ממדי ופיצוי טוב של כל דימום ספקטרלי בין חלבונים פלואורסצנטיים. קשה היה לחלק נתוני פולי-טרנספקציה עם מספר נמוך של תאים חיים למספיק פחים עם מספר מספיק של תאים בכל סל לניתוח. פולי-טרנספקציה עם יעילות טרנספקציה ירודה הביאה לכיסוי דליל של המרחב הדו-ממדי לניתוח.

יחס הדנ"א האפקטיבי על ביטוי הפלט נבדק על ידי הצבת חלבון מדכא, L7Ae עם mKO2, וחלבון פלט, ירוק ניאון עם TagBFP, בתערובות טרנספקציה נפרדות. לאחר מכן נוטר ביטוי ירוק ניאון ברמות שונות של mKO2 ו- TagBFP. תוצאות קו-טרנספקציה ופולי-טרנספקציה הושוו עבור מעגל זה.

תוצאות של 11 טרנספקציות משותפות בודדות ששילבו את חלקי הדנ"א שהוצגו קודם לכן נאספו למערך נתונים יחיד והושוו לנתוני הפולי-טרנספקציה. השוואה בין עקומות תגובת המינון של L7Ae המדכא את מדווח הפלט הראתה כי רמת התפוקה החציונית לסל הייתה דומה מאוד בין נתוני הטרנספקציה המשותפת ונתוני הפולי-טרנספקציה. יישום מוצלח של poly-transfection הודגם עבור אופטימיזציה של מסווג סוג התא.

המיקרו-רנ"א-21 הקיים בתאי HeLa ובתאים שאינם HEK פועל להפיל את הביטוי של BM3R1 מכיוון ש-BM3R1 מדכא את ייצור פלט המעגל mKO2. כאשר מיקרו-רנ"א 21 נמצא בתא, ביטוי mKO2 יופעל. כמות Gal4-VP16 מכווננת את ביטוי mKO2 ברמות נמוכות של BM3R1.

כל רכיב מעגל הועבר במשותף עם סמן פלואורסצנטי שונה. פולי-טרנספקציה זו מכמתת כמה מכל רכיב מעגל קיבל כל תא. mKO2 מיוצר ב-MIR21, ומייצר תאי HeLa אך לא בתאי HEK.

פלט mKO2 נותח לאחר העברת רכיבי מעגל אלה בתערובות טרנספקציה נפרדות עם כתבים פלואורסצנטיים נפרדים כדי לציין את הכמות של כל רכיב מעגל המתקבל על ידי תא מסוים. תת-דגימה זו חזתה כי ביחס זה, למעגל המשותף הייתה ספציפיות של 91%, רגישות של 62% ודיוק של 77%, בעת סיווג תאי HEK293 לעומת תאי HeLa. נקודת הכאב הנפוצה ביותר בפרוטוקול זה היא היעדר מתאם הדוק בתוך כל תערובת טרנספקציה.

לכן זכרו לערבב במרץ את צינורות הטרנספקציה מיד לאחר הוספת מגיב ההמרפר, ולאחר מכן היו עדינים עם ערבוב ופיפטציה של צינורות הטרנספקציה לאחר הוספת תערובת הטרנספקציה המכילה את השומנים. ניתן להחליף את המרכיבים הגנטיים בהליך זה בכל מרכיב גנטי אחר כדי לענות על שאלות לגבי תפקודם בסביבות שונות. שיטה זו פיתחה במהירות מעגלים גנטיים, כגון מסווגי תאים, בקרי משוב והזנה, מוטיבים דו-יציבים ועוד רבים.