ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד זקיקי שחלות מתאי הסטרומה הסובבים אותם כדי להעריך ניתוחי ביטוי גנים על תאי נבט אלה. טכניקה זו, תוך שימוש בבידודים אנזימטיים ומכניים מבוקרים, מאפשרת שליפת זקיקים תוך שמירה על שלמותם. בעקבות פרוטוקול זה, החוקר יכול להעריך ביטויי גנים ספציפיים מתאים אלה.

הטכניקה יכולה לשמש כדי להבין עוד יותר את הגירעון של ביטוי גנים בזקיקים הקשורים למחלות המשפיעות על תפקוד השחלות או לאחר חשיפה לחומרים רעילים. התחל להכין צלחת שש בארות על ידי הוספת חמישה מיליליטר של תמיסה cryoprotectant לבאר הראשונה וחמישה מיליליטר של ליבוביץ 15 בינוני עם ריכוזים הולכים ופוחתים של cryoprotectant לארבע הבארות הבאות. יש להסיר בקבוקון המכיל מקטע קליפת המוח השחלתית מחנקן נוזלי בהתאם לכללי הבטיחות.

לאחר 30 שניות בטמפרטורת החדר, או RT, השרו את הבקבוקון במים מזוקקים פעמיים למשך שתי דקות. בתוך מכסה מנוע אנכי, להתסיס בעדינות ולפתוח את בקבוקון שבר קליפת המוח השחלתית לפני העברת התוכן לתוך הבאר הראשונה של צלחת שש בארות מונח על קרח. לאחר מכן, העבירו את מקטע קליפת המוח השחלתית בבאר הראשונה ברצף לכל באר של צלחת שש בארות המכילה ריכוזים הולכים ופוחתים של cryoprotectant בחמישה מיליליטר של ליבוביץ 15 בינוני.

בעדינות לסעיר את הרקמה בכל מדיום במשך חמש דקות. לבידוד זקיקים, העבירו את רקמת השחלה המופשרת לצלחת פטרי מרושתת בקוטר שני מילימטר מלאה ב-10 מיליליטר תווך דיסקציה, 30 מיקרוגרם למיליליטר פניצילין G ו-50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. התאם את גודל הרקמה עם האזמל, במידת הצורך.

ערמו את שלושת חלקי חותך הרקמה והניחו את שבר השחלה בין שני הגושים. חותכים את השבר לשניים באמצעות להב, מחליקים דרך הבלוקים כדי להשיג שני שברים בעובי 0.5 מילימטר. חותכים את הרקמה באמצעות מסוק רקמות כדי לקבל את החתיכות הקטנות יותר.

במידת הצורך, חותכים את החתיכות הנותרות ידנית עם האזמל עד שהרקמה מרוסקת. לאחר שהרקמה מרוסקת, העבירו את הרקמה המקוטעת לצלחת פטרי מרושתת מלאה בשבעה מיליליטר של אמצעי עיכול לפני שתניחו את התבשיל באינקובטור בטמפרטורה של 5% פחמן דו חמצני ו -37 מעלות צלזיוס. קח את צלחת פטרי מן האינקובטור כל 10 דקות.

לשטוף את הרקמה על ידי pipeting את מדיום העיכול למעלה ולמטה עם פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר 45 דקות של דגירה בתווך העיכול, מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם טווח הגדלה של פי חמישה עד 6.3 ושולפים את הזקיקים באמצעות פיפטה מיקרו נימית. בחר את הזקיקים המעניינים ולבודד אותם על ידי מציצתם עם פיפטה בפה.

אם הזקיקים נשארים תקועים בחתיכת קליפת המוח, בודדו אותם מכנית עם שני מזרקים באורך 27 מד על ידי קריעת קליפת המוח עם קצה המזרקים ושחרור זקיקים מהסטרומה. בעזרת נימי המיקרו, מעבירים את הזקיקים המבודדים לצלחת בעלת ארבע בארות המכילה 15 מיקרוליטר של מדיום התרבית המכוילת המכוסה ב-500 מיקרוליטר של תרבית שמן. לאחר העברת אחד עד 10 זקיקים, לשטוף אותם פעמיים בשתי טיפות של 15 מיקרוליטר של PBS מכוסה 500 מיקרוליטר של תרבית שמן במשך חמש שניות כל אחד.

בעזרת פיפטת הפה, לאסוף 20 זקיקים עם PBS מינימלי בצינור ריק ולשמור את הצינור על קרח. לאחר 90 דקות של דגירה במדיום העיכול, לעצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת פתרון חוסם קר. מתחת למכסה המנוע הכימי, להשעות את הזקיקים המבודדים ב -100 מיקרוליטר של תמיסת הליזיס המסופקת עם ערכת מיצוי RNA.

מערבלים את הזקיקים המבודדים במהירות של 2500 סל"ד לדקה כדי לשבור את המבנה שלהם, ואז מוסיפים 50 מיקרוליטר של אתנול 100% לצינור. ולסובב בקצרה את הצינור במהירות גבוהה. לאחר הערבול, העבירו את הנפח הכולל של הצינור למכלול מחסנית מיקרו פילטר, הכולל עמוד וצינור איסוף.

וצנטריפוגה את ההרכבה למשך 10 שניות ב 16, 363 גרם בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את העמוד עם 180 מיקרוליטר של Wash Solution 1 שסופק עם הערכה לפני צנטריפוגה של הצינור למשך 10 שניות. לאחר מתן שתי שטיפות של 180 מיקרוליטר של Wash Solution 2, 3 לעמודה, יבש את המסנן על ידי צנטריפוגה של הצינור בפעם האחרונה והנח צינור איסוף חדש מתחת למחסנית.

כדי לבצע את elution של חומצות הגרעין, תחילה להוסיף שמונה מיקרוליטר של 75 מעלות צלזיוס Elution פתרון למכלול המסנן. לאחר דקה, צנטריפוגה את ההרכבה למשך 30 שניות. חזור על שלב זה עם שבעה מיקרוליטרים של תמיסת אלוציה.

לאחר שתסיים, הוסף שתי יחידות בינלאומיות DNase ו- DNase חיץ לצינור ודגור על הצינור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. חסום את הפעילות האנזימטית עם מגיב השבתה של DNase אחד על 10 למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור במשך 1.5 דקות ב 16, 363g בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את המתלה המכיל את RNA לצינור חדש.

באמצעות ספקטרופוטומטר, להעריך את כמות RNA בדגימה. השתמש בתמיסת Elution מיקרוליטר אחת כתמיסת RNA ריקה ומיקרוליטר אחד המופק מזקיקים מבודדים. בדוק אם יחס 260/280 הוא סביב 2.0 עבור טוהר RNA.

ולאחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס או ישירות רטרותמלל אותה לביצוע RT-qPCR. באמצעות פרוטוקול זה, שני מקטעי השחלות ההומוגניים של 4x2x1 מילימטר מאותה מטופלת עובדו כדי לבודד את הזקיקים. כימות הרנ"א גילה כי 4.8 ננוגרם למיקרוליטר מסך הרנ"א הופק מזקיקים בגודל של פחות מ-75 מיקרומטר עם יחס טוהר של 1.89.

מזקיקים של פחות מ-200 מיקרומטר הופקו 10.5 ננוגרם למיקרוליטר מסך הרנ"א ביחס טוהר של 1.74. ערכי מספר שלמות הרנ"א, או RIN, היו 7.1 ו-7.9 בצינורות 1 ו-2 בהתאמה, מה שאימת את איכות הרנ"א מהדגימות שלנו. לאחר הפעלת מחזור סטנדרטי במערכת PCR בזמן אמת, ספי המחזור, או CT, שהתקבלו היו 30.87 ו- 29.56 עבור HPRT, 33.5 ו- 31.77 עבור ליגנד קיט, ו- 30.71 ו- 30.57 עבור GDF9.

העיכול האנזימטי של הרקמה הוא נקודה קריטית. על הנסיין להעריך באופן רציף ולהבטיח את שלמות הזקיק במהלך התגובה על ידי הפסקתו בעת הצורך. מלבד ניתוח ביטוי גנים, זקיקים מבודדים משמשים לפיתוח מערכות ניסיוניות לשימור פוריותם של חולי סרטן, כמו זקיק בתרבית חוץ גופית או שחלות מלאכותיות.

טכניקת הבידוד דרשה עקומת למידה לשליפת מספר גבוה של זקיקים שלמים. מומלץ לחוקרים לוודא שהרקמה מרוסקת היטב לפני העיכול.