מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול
2 ביוני 2023
במאמר זה מתואר פרוטוקול להגברת אות טירמיד ידנית (TSA) מולטיפלקס אימונופלואורסנציה (mIF) בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מקטעים משובצי פרפין קבועים פורמלין (FFPE) לצביעה של שניים עד שישה אנטיגנים לכל שקופית, בהתאם לסורק השקופיות הזמין במעבדה.
במעבדה שלנו אנו חוקרים את סרטן המעי הגס האנושי. התקדמותו למחלה גרורתית ותגובתו לטיפול, כולל אימונותרפיה. אנו מנסים למצוא סמנים ביולוגיים מנבאים ופרוגנוסטיים חדשים על ידי חקירת המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול והמיקרוביום התוך-גידולי במחלות ראשוניות וגרורתיות.
בפרויקט שלנו אנו מיישמים כיום מספר טכנולוגיות כגון ריצוף RNA, ריצוף אקסומי שלם, ריצוף TCR במחזור ניתוח DNA ללא תאים, אימונופלואורסנציה והכלאה של מכון פלואורסצנטי. ברגע זה, האתגר העיקרי שלנו הוא לשלב את צביעת ההכלאה של המכון הפלואורסצנטי עם מולטיפלקס של הגברת אותות טירמיד כדי לחקור את האינטראקציה בין המיקרוביום לבין תאי החיסון. השיטה שלנו חזקה, ניתנת לשחזור, קלה לשימוש וחסכונית.
ניתן להתקין אותו בכל מעבדה בעלת סורק אור פלואורסצנטי, ובנוסף ניתן להשתמש בשיטה עם כל נוגדן IHC זמין מסחרית, בניגוד לערכות זמינות מסחריות שבדרך כלל מותאמות לפאנל מוגבל של אנטיגנים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול להגברת אות באמצעות טיראמיד (TSA) בשיטת אימונופלואורסצנציה מרובת-סמנים (mIF) ידנית, בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. השיטה ישימה עבור חתכים מקובעים בפורמלין ומוטמעים בפראפין (FFPE) לצורך צביעה של אנטיגנים מרובים על גבי שקופית אחת.
מרכיבים מרכזיים במחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- פתולוגיה
רקע
- חקירה של סרטן המעי הגס והחלק האחורי של המעי הגס בבני אדם והתקדמותו.
- התמקדות במיקרו-סביבה החיסונית של הגידול ובמיקרוביום התוך-גידולי.
- שימוש בטכנולוגיות שונות, כולל רצף RNA ופלואורסצנציה עקיפה.
- אתגרים בשילוב שיטות צביעה שונות לצורך ניתוח מקיף.
מטרת המחקר
- למציאת סמנים ביולוגיים (biomarkers) חדשים לחיזוי ולפרוגנוזה.
- לבחינת האינטראקציה בין המיקרוביום לתאי מערכת החיסון.
- לפיתוח שיטת צביעה חסונה ו可שחזרת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגברה ידנית של אותי טירמיד (tyramide signal amplification) באימונופלורסצנציה מולטיפלקס.
- ניתוח תמונות באמצעות אלגוריתמים של פלואורסצנציה בעלת רזולוציה גבוהה (high-plex).
- הכלה של פלואורסצנציה באתר (FISH) בשילוב עם אימונופלורסצנציה.
- פרוטוקול צביעה מפורט עבור חתכי רקמה בקיבוע FFPE.
תוצאות עיקריות
- צביעה מוצלחת של אנטיגנים מרובים על גבי פ slide בודד.
- אופטימיזציה של ספציפיות הנוגדנים ויחס אות לרעש.
- ניתוח תמונה יעיל המניב נתונים מדידים.
- הדגמת התאימות של השיטה למעבדות שונות.
מסקנות
- שיטת ה-TSA mIF היא ורסטילית וחסכונית בעלויות.
- ניתן להתאימה עבור נוגדנים ואנטיגנים שונים.
- גישה זו משפרת את ההבנה של הביולוגיה של הגידול.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
אימונופלואורסצנציה מרובת-ערוצים (mIF) עם אנליזה מרחבית של תמונות מאפשרת מיפוי כמותי ועשיר במידע של הסביבה המיקרובית של הגידול (TME), ובכך תומכת בגילוי ביומרקרים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בקווי פיתוח אונקולוגיים. סבב עבודה זה מספק תובנות יישומיות לגבי אינטראקציות בין תאי חיסון לתאי סטרומה, המכוונות אסטרטגיות של ביומרקרים חיזויים ומחקרים תרגומיים. יכולת השחזור שלו והתאימות לנוגדנים מגוונים מציבות אותו ככשרון בר-הרחבה עבור מו"פ אונקולוגי ברמה ארגונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה במחלוט מרחבי של אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון לתאי גידול לצורך תיקוף של מטרות טיפוליות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות צפיפויות וקרבות של סוגי תאים בתוך מדורי הגידול.
- מסייע בזיהוי של סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים וניבויים חדשים לצורך מיון של תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות רקמות שעברו תיקוף לצורך סריקת סמנים ביולוגיים (biomarkers) מרובת-ערוצים (multiplexed) בהמשך התהליך.
- מספק נתונים מרחביים סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים עבור פיתוח בדיקות.
- מאפשר הערכה חסונה של ספציפיות נוגדנים ואופטימיזציה של יחס אות לרעש לצורך מוכנות לסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את ניתוח הסמנים הביולוגיים המרחביים למודלים רלוונטיים למחלה לצורך רצף תרגומי.
- תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור מאפייני ה-TME להיפותזות של תגובה טיפולית.
- מספקת פלטיים כמותיים להשוואות בין מחקרים ובין קבוצות במחקר פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
תהליכון עבודה זה ל-mIF ולניתוח מרחבי מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף של סמנים ביולוגיים ומחקר תרגומי בתיקי מחקר של אונקולוגיה.
- ביולוגיית גילוי: מכמת התפלגויות של תאי מערכת החיסון ותאי הסטרומה כדי להבהיר מנגנונים המונעים על ידי ה-TME.
- סריקה: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות רקמה מרובות-סמנים (multiplexed) לקבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליזה: מייצא נתוני מרחב וצפיפות להשוואה סטטיסטית של מדורי גידול ואינטראקציות בין תאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דפוסי סממנים ביולוגיים מרחביים לתגובה טיפולית, ובכך תומך ברצף מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לכל פאנל נוגדנים וסוג גידול, מה שמאפשר יישום רחב של פורטפוליו המחקר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת סמני ביולוגיים ומטרות על ידי פיתרון אינטראקציות תאיות מרחביות.
- ערך תפעולי: מספק ניתוח רקמות מרובה-סמנים (multiplexed) הניתן לשחזור, ניתן להרחבה ובעל יעילות כלכלית.
- ערך אסטרטגי: מספק תובנות לקבלת החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות אפיון חסון של ה-TME.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד סדרי עדיפויות מותאם-סיכון של נכסי אונקולוגיה בהתבסס על ראיות של סמנים ביולוגיים מרחביים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונופלורסנציה, ניתוח תמונות ועיבוד נתונים סטטיסטיים.
- נדרשת גישה לסורק שקופיות פלואורסצנטי ולתוכנה תואמת לניתוח תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תיקוף נוגדנים ופרוטוקולי צביעה.
- ניתן להתאמה לסוגי גידולים ולוחי נוגדנים שונים באמצעות אופטימיזציה מתאימה.
- תלוי בספציפיות קפדנית של הנוגדנים ובאופטימיזציה של יחס אות לרעש לקבלת תוצאים מהימנים.
