בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי
13 באוקטובר 2023
הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.
ככל שהידע שלנו בביולוגיה של הגידול גדל והעניין להבין את המורכבות של האופן שבו תאים מתקשרים בתוך הגידול ומשפיעים על תוצאות המטופלים, גדלה גם החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים ברחבי המיקרו-סביבה של הגידול. ריצוף מולטיום, המאפשר רכישת RNA של תא בודד וריצוף תקיפה מאותו תא בצורה של תא מזווג, מספק התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו. עם זאת, איכות הנתונים המתקבלים מניסויים אלה תלויה מאוד באיכות תנאי הניסוי ובחומר הביולוגי המוקלט.
פרוטוקול זה מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידול מוצקות לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics. פרוטוקול זה אמין באמצעות מתלים טריים או קפואים של תא בודד. אנו מספקים המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים של תא בודד והערכה של גרעינים מבודדים.
בפרוטוקול זה, השתמשנו בדגימות אדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי, שהן סוג רקמה עיקרי במעבדה שלנו. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמה דביקה יחסית, כמו גם תאים. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות גם הן להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות של גידולים מוצקים עבור ריצוף multi-om באמצעות פלטפורמת 10x Genomics. הוא כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות ולשימור בהקפאה (cryopreservation) של תרחיפי תאים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- גנומיקה
רקע
- הבנת הביולוגיה של הגידול חיונית לשיפור תוצאות הטיפול במטופלים.
- ניתוח של תאים הטרוגניים בסביבה המיקרוסקופית של הגידול הופך לחשוב יותר ויותר.
- ריצוף מולטי-אומיקה (Multi-om sequencing) מאפשר רכישה זוגית של ריצוף RNA וריצוף ATAC ברמת התא הבודד.
- איכות הנתונים תלויה במידה רבה בתנאי הניסוי ובחומר הביולוגי.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מהימן לבידוד גרעינים מגידוליים מוצקים.
- לשפר את איכותן של נתוני רצף מולטי-אומי (multi-om sequencing).
- להקל על ניתוח סביבות מיקרו של גידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד גרעינים מדגימות של גידולים מוצקים.
- שימוש בתליי תאים בודדים טריים או קפואים.
- המלצות לתנאי דיסוסיאציה של רקמות.
- טכניקות קריו-שימור עבור תליי תאים בודדים.
תוצאות עיקריות
- בוצע אופטימיזציה לגישה לבידוד גרעינים.
- הושגו תוצאות מהימנות הן מדגימות טריות והן מדגימות קפואות.
- איכות הנתונים לרצף multi-om שופרה.
- סופקו הנחיות לעיבוד רקמות ולשימור בהקפאה (cryopreservation).
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את מהימנות בידוד הגרעינים מגידולים.
- הוא תומך בקידום טכניקות של ריצוף מולטי-אומיקה (multi-om sequencing).
- מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת מתנאים ניסיוניים משופרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד אופטימלי של גרעיני תאים מדגימות של גידולים מוצקים הוא קריטי ליצירת נתוני ריצוף מולטי-אום (multiome) באיכות גבוהה, ומשפיע ישירות על מהימנותם של ניתוחים של הטרוגניות גידולים באונקולוגיה תרגומית. פרוטוקול זה נותן מענה לאתגר של מיצוי גרעינים שלמים מרקמות גידולים דסמופלסטיות, הן טריות והן קפואות, ובכך תומך בפרופיל מולטי-אומי חסון ברמה של תא בודד. הכנת גרעינים מהימנה בשלב זה מגבירה את הביטחון החזוי בצינורות העבודה של גילוי ותהליכי פיתוח של ביומארקרים בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ברמת דיוק גבוהה של ההטרוגניות של תאי גידול ברמה של תא בודד.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי שימור אוכלוסיות תאים מגוונות במהלך הבידוד.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים באמצעות ייצוג מדויק של הסביבה המיקרוסקופית של הגידול.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת הכנות גרעינים סטנדרטיות עבור בדיקות רצף מולטי-אומים (multiome sequencing) הניתנות לשחזור.
- מבטיח עקביות כמותית ואיכותית בחומר הקלט עבור תהליכי עבודה המשכיים.
- משפר את מוכנות הבדיקה על ידי התאמה לדגימות גידולים טריות ודגימות קריו-משומרות כאחד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם גילוי סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי אפשור פרופילינג משולב של RNA ונגישות כרומטין.
- שומר על רלוונטיות למחלה על ידי לכידת המורכבות של מיקרו-סביבות של גידולים מוצקים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות סטנדרטיזציה של איכות החומר המוזן.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול בידוד הגרעינים זה ממוקם בממשק שבין עיבוד רקמות לבין יצירת נתונים מולטי-אומיים, ומגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין תהליכי עבודה של מחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: ממקסם את כוח בדיקת ההשערות על ידי שימור הגיוון והשלמות של התאים.
- סריקה (Screening): מספק גרעינים בעלי איכות גבוהה וניתנים לשחזור עבור בדיקות רצף מולטי-اومיקה (multiome) ברמות קנה מידה משתנות.
- אנליטיקה: מאפשר קריאות כמותיות חזקות להשוואת מצבי תאי גידול ומסכי כרומטין.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמת סמנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי תמיכה בניתוחי RNA ותאי ATAC-seq משודכים ברמת התא הבודד.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול סטנדרטי וסתגלן לסוגים שונים של גידולים מוצקים ולמצבי דגימה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בביולוגיה של גידולים ובמחקרים של תיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) על פני דגימות גידולים טריות וקפואות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לאובדן נתונים או להחדרת ארטיפקטים בשלב הכנת הדגימה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם-סיכון של תוכניות גילוי ותרגום (translational programs) בתחום האונקולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפירוק רקמות ובטיפול בגרעינים להשגת תפוקה ואיכות אופטימליות.
- מחייב גישה לריאגנטים ייעודיים, מסנני תאים וכלים להערכה כמותית.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי העיכול והליזיס לצורך הדירות (reproducibility).
- חייב להיות מותאם לסוגי גידולים ולגדלי דגימות שונים, במיוחד עבור רקמות דסמופלסטיות.
- ניטור קפדני של שלמות הגרעינים חיוני כדי למנוע ארטיפקטים של ריצוף בשלבים הבאים.
