תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo
9 בפברואר 2024
וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .
אנו משתמשים בגישת אבולוציה מכוונת כדי לזהות קפיטים נגיפיים הקשורים באדנו עם טרופיזם גבוה יותר עבור סוגי תאים אנושיים ממוקדים. באמצעות מחקר זה, אנו שואפים לייצר וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו עם התמרה משופרת של תאי מטרה ורלוונטיות קלינית בתחום הריפוי הגנטי. הקבוצה שלנו ביטלה לאחרונה מספר סרוטיפים AAV מהכבד על ידי שילוב שאריות קפסיד מקוריות לסרוטיפ AAV שיש לו באופן טבעי טרופיזם כבד מופחת.
אם יורחב בהצלחה לסרוטיפים נוספים, זה מספק את הבסיס להפחתת המינון הקליני הדרוש של RAAV על ידי הזרקה היקפית ולהפחית את התוצאות השליליות של המטופלים. שיטת טיהור IODIXanol בעוד שהיא חסכונית קשה להרחבה. בנוסף, ביישומים במורד הזרם, גישת האבולוציה המכוונת מבוצעת עם מודלים של בעלי חיים או במבחנה.
לכן, קפסיד המבודד על ידי אבולוציה מכוונת עשוי שלא להתמיר מטרות in vivo בבני אדם באותה מידה כמו במודלים פרה-קליניים. פרוטוקול זה הוא זול ונגיש עבור מעבדות קטנות יותר. בנוסף, שיטה זו מניבה טוהר גבוה, וירוס הקשור אדנו רקומביננטי שניתן להשתמש בו עבור יישומים פרה-קליניים in vivo במורד הזרם.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד באבולוציה מכוונת של קפסידים של נגיפי adeno-associated (AAV) כדי לשפר את הטרופיזם שלהם לסוגים ספציפיים של תאי אדם. המחקר שואף לפתח וקטורי AAV רקומביננטיים המשפרים את התעתוק (transduction) של תאי המטרה, דבר שהוא קריטי ליישומים של טיפול גנטי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- תרפיה גנית
- נגיפים אדנו-אסוסיאטיביים
- פיתוח וקטורים נגיפיים
רקע
- נגיפים אסוציאטיביים לאדנו (Adeno-associated viruses) משמשים בטיפול גנטי בשל בטיחותם ויעילותם.
- שיפור הטרופיזם עשוי להוביל לתוצאות טיפוליות טובות יותר.
- שיטות נוכחיות לייצור וטיהור של AAV עלולות להיות מאתגרות להרחבה (scale).
- אבולוציה מכוונת מציעה אסטרטגיה לשיפור תכונות של וקטורים נגיפיים.
מטרת המחקר
- זיהוי קפסידי AAV בעלי טרופיזם מוגבר לתאים אנושיים.
- הפחתת הטרופיזם לכבד בסרוטיפים מסוימים של AAV.
- הפחתה פוטנציאלית של המינון הקליני הנדרש לטיפול גנטי יעיל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גישת אבולוציה מכוונת לשינוי הקפסייד.
- שימוש במודלים של בעלי חיים ובמערכות in vitro לצורך בדיקה.
- סנטריפוגציה במדרג צפיפות של Iodixanol לטיהור הנגיף.
- הערכת תנובת החלקיקים הנגיפיים ויעילות הטרנסדוקציה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי קפסידים בעלי טרופיזם משופר לתאי מטרה.
- הסרה מוצלחת של המכוון (detargeting) של סרוטיפי AAV מהכבד.
- הדגמה של יכולות טרנסדוקציה מוגברות במודלים פרה-קליניים.
- ביסוס של שיטת טיהור ניתנת להרחבה (scalable), למרות הקשיים בכך.
מסקנות
- אבולוציה מכוונת יכולה לשפר ביעילות את תכונות הקפסיד של AAV.
- הפחתה של הטרופיזם לכבד עשויה להוביל ליישומים בטוחים יותר של טיפול גנטי.
- נדרש מחקר נוסף כדי להרחיב ממצאים אלו לסרוטיפים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ייצור בתרבית סוספנסיות וטיהור באמצעות מדרג צפיפות של iodixanol של rAAV מאפשרים אספקה של וקטורים בדרגת טוהר גבוהה למחקרים פרה-קליניים in vivo, ובכך תומכים בקידום של תוכניות פיתוח לטיפול גנטי. פרוטוקול זה, שאינו תלוי בסרוטיפ, מקל על יצירת קפסידים מגוונים של AAV, כולל כאלו שעברו הנדסה לשינוי טרופיזם, ומספק בסיס הדיר במידה לפיתוח וקטורים טרנסלציונליים. נגישות השיטה ועקביות התוצר קריטיות לאופטימיזציה של וקטורים בשלבים מוקדמים ולמיון תיקי הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ייצור של וריאנטים של rAAV לצורך בחינה תפקודית של יעילות העברת גנים בסוגי תאי מטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת וקטורים למחקרי טרנסדוקציה ספציפיים לרקמות ולמסלולים.
- מקל על בניית אבות-טיפוס מהירה ותיקוף של קפסידים מהונדסים עם טרופיזם משונה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק rAAV מרוכז בדרגת טוהר גבוהה, המתאים למבדקי סריקה כמותיים in vitro ו-in vivo.
- מנstandardיז את כמות הווקטור המוכנס לצורך פיתוח מבחנים הניתנים לשחזור והשוואות בין מחקרים.
- מאפשר סקלאביליות לסריקה של וריאנטים מרובים של קפסידים או מבני טרנס-גן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק וקטורים למחקרי מודלים פרה-קליניים בבעלי חיים להערכת טירגוט רקמות והשפעות חוץ-מטרה (off-target effects).
- תומך בהלימה של ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי מתן אפשרות לוולידציה in vivo של ביצועי הווקטור.
- מפחית את הסיכון למזהמי חלבון מתבלבלים (confounding) במחקרי יעילות ובטיחות בהמשך התהליך.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין התיקוף הפרה-קליני באמצעות אספקת rAAV באיכות גבוהה הן למחקרים מכניסטיים והן למחקרים תרגומיים. הוא מוגדר כיכולת ליבה עבור תהליכי הנדסת וקטורים, סריקה והוכחת היתכנות (proof-of-concept) in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: מספק וקטורים לבדיקה מבוססת השערות של מודיפיקציות לקפסיד ומיקוד לרקמות.
- סריקה: מספק rAAV סטנדרטי בטיטר גבוה לפיתוח תבחינים חסונים ולניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה כמותית של תנובת החלקיקים הוויראליים ושל רמת הניקיון לצורך אופטימיזציה של התהליך.
- מחקר תרגומי: תומך ברצף מהסריקה in vitro לוולידציה in vivo במודלים של בעלי חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך עבודה רחב-applicability שאינו תלוי בסרוטיפ עבור תוכניות מגוונות לטיפול גנטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון התחזית לגבי ביצועי הווקטור ותיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק ייצור rAAV הניתן לשחזור, ניתן להרחבה וחסכוני עבור צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go עבור מועמדים לווקטורים ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של קפסידים מהונדסים ומבני טרנס-גן.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של תרביות תאים בסספנסיות, טרנספקציה ואולטרה-צנטריפוגציה.
- נדרשת גישה לאולטרה-צנטריפוגות, משאבות פריסטלטיות וכלים אנליטיים להערכת טיטר וטוהר.
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית לצורך הדירות והשוואתיות בין מחקרים.
- ההתאמה לייצור בקנה מידה גדול מוגבלת על ידי יכולת ההרחבה (scalability) של צנטריפוגציה במדרג iodixanol.
- הפרוטוקול מותאם לאספקת וקטורים בקנה מידה מחקרי ולא לייצור בדרגה קלינית.
