בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב
17 בינואר 2025
אנו מתארים שיטה לניצול לימפוציטים חודרים לגידול (TILs) מעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה להעברת תאים מאמצים. פרוטוקול זה נועד לאמת את הציטוטוקסיות הספציפית של TIL כנגד גידולים במודל עכברי סרטן הלבלב סינגני, ולספק תובנות לגבי התפתחות טיפולים תאיים מאמצים לסרטן הלבלב.
אנו מתמקדים בפיתוח שיטה לבידוד ואימוץ לימפוציטים חודרים לגידול, TILs, במודל סרטן הלבלב. אנו מנסים לענות על השאלה האם תת-הקבוצות של TIL יכולות למקד ולהרוג ביעילות גידולי לבלב in vivo וכיצד ניתן לבצע אופטימיזציה של תאי T לניסויים קליניים עתידיים. התפתחויות אחרונות בטיפול בתאים מאמצים, כולל שיפור טכניקות בידוד וביטוי TIL, שינוי עדין של TIL כדי לשפר את המיקוד שלהם ושילוב טיפול TIL עם אימונותרפיות אחרות כמו מעכבי מחסום או טיפולים ממוקדים ליעילות אנטי-גידולית מוגברת.
הקמנו שיטה חזקה לבידוד והרחבה של TIL תגובתי גידול ממודל עכברי סרטן הלבלב. הדגמנו יעילות אנטי-גידולית משופרת של תאי T מגיבים לגידול שהועברו באימוץ. הפרוטוקול שלנו מציע גישה ממוקדת יותר לטיפול בתאים מאמצים על ידי מתן אפשרות לבידוד ובחירה של TIL ספציפיים לגידול בהשוואה לשיטות אחרות פחות ספציפיות.
הוא משמש גם על ידי הדמיה ביולוגית לניטור גידול לא פולשני. הממצאים שלנו יקדמו את התחום על ידי מתן מודל פרה-קליני סטנדרטי להערכת יעילות הטיפול ב-TIL ואופטימיזציה של פרמטרי הטיפול של תת-קבוצות תאי T לסרטן הלבלב. כדי להכין תרחיף תאי KPC-Luciferase להשראת גידול לבלב אורתוטופי בעכברים, נסה את קו התאים KPC-Luciferase למשך דקה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר הטריפסיניזציה, הוסף PBS, העביר את התאים ולאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התאים. ספרו את התאים והשעו אותם מחדש בריכוז של 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר ב- PBS המכיל 30% מטריצת קרום מרתף. הנח את העכבר המורדם על פלטפורמת הפעלה.
לאחר ביצוע חתך בבטן שמאל של 0.5 עד 1 סנטימטר, החזיקו את הטחול בעזרת מלקחיים וחשפו את הלבלב. לאחר הכנת תאי KPC-Luciferase ותערובת מטריצת קרום המרתף, הזרקו 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים המכיל 50,000 תאים לתוך הלבלב באמצעות מחט בגודל 29. מחזירים את הלבלב לחלל הבטן.
תפר ברצף את הצפק והעור. אפשר לעכבר להתאושש על משטח חם עד שהוא ער לחלוטין. לאחר שבעה ימים, יש להזריק לעכבר 60 מיקרוליטר של תמיסת מלח אשלגן D-Luciferin להדמיה חיה.
לאחר ההרדמה, מקם את העכבר במערכת ההדמיה in vivo לזיהוי ביולומינסנציה. לאחר ההדמיה, הסר את העכבר מהמערכת ואפשר לו להתאושש באופן טבעי מההרדמה. כדי להתחיל, הנח את העכבר המתת החסד של התורם על פלטפורמת הפעלה.
עקר את כל הגוף עם 75% אתנול. במכסה מנוע סטרילי, השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לפתוח את חלל הבטן. הסר את הגידול והנח אותו ב-PBS על קרח.
מדוד את גודל הגידול בקליבר ורנייה. לאחר מכן, חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה שעל המסך. לאחר הכנת תמיסת העיכול 1X באמצעות קולגנאז, Dispase II ו-DNAse I ב-RPMI 1640, הוסף מיליליטר אחד עד שניים מהתמיסה לכל באר בצלחת של 12 בארות.
טוחנים את הגידולים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. העבירו את חלקי הגידול לכל באר בצלחת של 12 בארות ועכלו אותם ב-37 מעלות צלזיוס תוך ניעור ב-70 סל"ד למשך 30 דקות. כדי להפסיק את העיכול, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של סרום בקר עוברי של 10% והעביר את תרחיף התאים לצינור איסוף.
שטפו את הבארות של צלחת 12 בארות פעמיים עם PBS כדי לאסוף את כל התאים שנותרו. מסננים את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר, טוחנים ומועכים את שברי הרקמה כדי לשחרר את התאים הבודדים באמצעות הקצה השטוח של בוכנת מזרק. צנטריפוגה של המסנן ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשהה מחדש את הגלולה באלבומין סרום בקר של 5% לצביעה ציטומטרית זרימה.
כדי להתחיל, הנח את התאים שבודדו מהעכבר הנושא את הגידול יחד עם הטחול או התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי מהעכבר שאינו נושא גידול על משטח עבודה. תאי כתמים עם חוסמי FC ונוגדני זרימה בדילול של 1 עד 100. דגרו את הצינורות על קרח בחושך למשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS על ידי צנטריפוגה לפני השעיית התאים באלבומין סרום בקר 1% ב-PBS. על ציטומטר זרימה, כדי למיין תאי CD45+CD3+, שער תאים חיים המבוססים על FSC-A ו-SSC-A ליצירת שער P1. לאחר מכן, שער תאים בודדים מ-P1 בהתבסס על FSC-A ו-FSC-H כדי ליצור שער P2. מיין תאי CD45+CD3+מ-P2 באמצעות שער CD45 ו-CD3. אוספים את התאים הממוינים לצינורות איסוף.
צנטריפוגה מיינה תאי CD45+CD3+ ב-400 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים בסרום העכבר בריכוז של 1 כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר, והניחו אותם על קרח. הנח את העכבר הנמען המושרה על ידי הגידול על פלטפורמת הפעלה.
בעזרת מזרק אינסולין בגודל 29 אינץ', הזרקו תוך צפקית את תאי החיסון הממוינים. לאחר מכן, יש לתת אינטרלוקין-2 תוך צפקי במשך שלושה ימים רצופים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לבידוד והעברה של לימפוציטים חודרי גידול (TILs) במודל של סרטן הלבלב. מטרת המחקר היא להעריך את היעילות של תתי-אוכלוסיות של TILs במיקוד ובחיסול של גידולי לבלב in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- אונקולוגיה
- תרפיה תאית
רקע
- TILS הם קריטיים לתגובה החיסונית נגד גידולים.
- טיפול תאי מאמץ (Adoptive cell therapy) הראה הבטחה בטיפול בסרטן.
- סרטן הלבלב מציב אתגרים ייחודיים עבור אימונותרפיה.
- שיפור בידולם ובמיקוד של TILs חיוני לטיפולים יעילים.
מטרת המחקר
- בידוד והרחבה של TILs מגיבים לגידול מדגם עכברים של סרטן הלבלב.
- הערכת הפעילות הציטוטוקסית של ה-TILs נגד גידולי לבלב.
- אופטימיזציה של טיפולים בתאי T ליישומים קליניים עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציטומטריה של זרימה לבידוד TIL.
- טכניקות של העברה מאמצת של תאים.
- בדיקות למיקוד גידולים in vivo.
- טיפולים משולבים עם מעכבי נקודות בקרה.
תוצאות עיקריות
- הוכח כי TILs המגיבים לגידול בעלי יעילות אנטי-גידולית מוגברת.
- בסס שיטה חזקה לבידוד ולהרחבה של TILs.
- הראה את הפוטנציאל של שילוב טיפול ב-TILs עם אימונו-תרפיות אחרות.
- סיפק תובנות לאופטימיזציה של TILs עבור ניסויים קליניים.
מסקנות
- המחקר מציע גישה ממוקדת לטיפול תאי מאומץ (adoptive cell therapy).
- TILs מבודדים מראים פוטנציאל במיקוד יעיל נגד גידולי לבלב.
- מחקרים עתידיים צריכים להתמקד ביישומים קליניים של TILs שעברו אופטימיזציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בידוד והעברה אדופטיבית של לימפוקיטים חודרי גידול (TILs) באמצעות פלוו ציטומטריה במודל עכברים לסרטן הלבלב נותנים מענה לפער קריטי בפיתוח אימונותרפיה פרה-קלינית. זרימת עבודה זו מאפשרת הערכה מדויקת של יעילות תתי-אוכלוסיות של TILs, ובכך תומכת בביטחון חיזוי באימות יעדים ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור מסלולי פיתוח של תרפיות תאיות. גישה זו מספקת פלטפורמה סטנדרטית לאופטימיזציה של עיבוד תאים ומשטרי טיפול משולבים, ובכך מזינה באופן ישיר החלטות הנוגעות לקידום תרגומי וניהול פורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד תת-אוכלוסיות של TIL ושל ספציפיות לגידול in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד והרחבה של לימפוציטים מגיבים לגידול.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירה ובתיקוף של מטרות לאימונותרפיה.
סינון ופיתוח בדיקות
- מספק אוכלוסיות תאי מערכת חיסון מתוקפות עבור בדיקות ציטוטוקסיות ויעילות המשכיות.
- מסטנדרט את בידודם והתרבותם של TILs לצורך פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור.
- מאפשר הערכה כמותית של תגובת הגידול באמצעות דימות בביולומינצנציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לתגובות חיסוניות הרלוונטיות למחלה בסרטן הלבלב.
- תומכת באופטימיזציה של פרמטרי עיבוד תאים ושל משטרי אימונותרפיה משולבים.
- מאפשרת ניטור אורך של יעילות טיפולית in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ומגשרת בין תיקוף המטרה, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי עבור טיפולים בתאי תמיכה מאומצים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי ציטוטוקסיות של גידולים המתווכת על ידי TIL והבהרה של מסלולים חיסוניים.
- סינון: מספק תוצריים כמותיים וניתנים לשחזור להערכת יעילות תאי מערכת החיסון.
- אנליטיקה: מספק נתוני הדמיה ביולומנסנטית וציטומטריה של זרימה לניתוח השוואתי של תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות לטיפול תאי.
- שימוש חוזר ארגוני: מקים פלטפורמה לשימוש חוזר להערכה ואופטימיזציה של זרימות עבודה באימונותרפיה אדופטיבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזואי ומפחית עמימות מכניסטית בפיתוח אימונותרפיה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד, הרחבה וניטור של TIL עבור מחקרים פרה-קליניים ניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכונים במועמדים לטיפול תאי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של נכסי אימונותרפיה בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בציטומטריה של זרימה, בטיפול בתאי מערכת החיסון ובדימות in vivo.
- דורש גישה למכשור ייעודי למיון תאים ולניטור ביו-לומניסנטי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לעיבוד תאים ולבדיקות (assays).
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מודלים שונים של גידולים או תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון.
- התפוקה והיכולת להרחבה (scalability) מוגבלות על ידי הלוגיסטיקה של מודל החיות והתרבות התאים.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:17
Inducing Orthotopic Pancreatic Tumors in Mice Using KPC-Luciferase Cells
4:04
Orthotopic Pancreatic Tumor Harvesting and Single-Cell Preparation for Flow Cytometry
5:53
Flow Cytometry-Guided Tumor Cell Isolation, Adoptive Transfer, and Tumor Monitoring in Pancreatic Cancer Recipient Mice
