בדיקת החלקה של מעבדת בטיחות פריון
14 בפברואר 2025
חסרה שיטה להערכת אזורים נפוצים במעבדות לזיהום פריונים וטיהור יעיל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק יסודות מרכזיים ליישום בדיקת בטיחות פריון מעבדה שניתן לשנות בקלות כדי לענות על הצרכים האישיים של מעבדות ספציפיות.
הקבוצה הרב-תחומית שלנו מנסה להבין כיצד חלבון זיהומי, פריון, יכול לבצע משימות ביולוגיות מורכבות. אנו מתעניינים גם באופן שבו פריונים יכולים להישאר בסביבה במשך שנים עד עשרות שנים. בעקבות הליכי טיהור פריונים, שיטה חזקה לקביעת היעילות של השבתת פריונים לא הייתה זמינה.
אנו מנסים לטפל בנושא זה באמצעות המחקר שלנו. שיטת המטוש, בשילוב עם RT-QuIC, מאפשרת לדגום מגוון רחב של משטחים כדי לזהות פעילויות זריעת פריונים. זה יכול לשמש לזיהוי פריונים הקשורים לפני השטח בסביבות מעבדה, קלינית או סביבתית.
אני מעוניין להבין כיצד פריונים מתקשרים עם משטחים ואת הדרישות של פריונים הקשורים לפני השטח כדי ליצור זיהום. כדי להתחיל, לזהות ולתייג אזורי מעקב מתאימים למטוש. הכינו שני צינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר לכל אזור מזוהה והוסיפו 250 מיקרוליטר של DPBS לצינור הראשון, תוך השארת השני ריק.
יש לאחזר מטושים מוקצפים מאחסון באזור נקי מזיהום פריונים. הכן את הבקרות החיוביות והשליליות באמצעות הומוגנאטים מתאימים במוח או BH ב- DPBS. בעזרת כפפות נקיות, שלפו את המספר הנדרש של מקלוני קצף מהאריזה והניחו אותם בצד כלפי מטה לתוך מדף צינורות.
לוודא שהקצוות אינם באים במגע עם משטחים אחרים. החזקת מקלון קצף נקי ליד הידית, להחיל 50 מיקרוליטר של דגימות ביקורת חיוביות ושליליות בהתאמה על קצות מטוש. בעזרת מספריים, חתכו את הידית העודפת של המקלון לכמחצית מאורכו והניחו את המקלון בצינור מיקרו צנטריפוגה טעון מראש כדי לטבול את קצה הקצף ב-DPBS.
החזיקו ליד הידית מקלון קצף נקי, הרטיבו מראש את קצה הקצף במים מולקולריים ונערו את עודפי המים. הניחו את קצה הקצף הלח על האזור שנבחר למעקב ובצעו ספוגית קדימה ואחורה כ-10 פעמים תוך סיבוב בו זמנית של קצה המקלון על פני השטח. בעזרת מספריים, חתכו את הידית העודפת של המקלון לכמחצית מאורכו והכניסו את המקלון לצינור מיקרו צנטריפוגה טעון מראש כדי לטבול את קצה הקצף ב-DPBS, מה שמבטיח שהמכסה יוכל להיסגר לחלוטין.
השליכו את הכפפות והחליפו אותן בכפפות חדשות לפני שתמשיכו לאתר המטוש הבא כדי למזער זיהום צולב. למיצוי מטוש, הניחו את צינור המיקרו צנטריפוגה במתלה צינור עגול והטביעו את המתלה באמבט המים של קרן הכוס. ודא שספוגית הקצף ב- DPBS בתוך הצינור נמצאת מתחת לפני המים, ומשאירה את חלקי הידית לא שקועים.
בצע סריקה של הדגימה למשך 15 שניות בסך הכל עם חמש שניות מופעלות וחמש שניות מחוץ למחזורים. לאחר הסוניקציה, צנטריפוגו את הצינור למשך כ-15 שניות כדי לאסוף את ה-DPBS בתחתית הצינור לפני ההעברה. באמצעות פיפטה P 1000 להגדיר 250 מיקרוליטר, בזהירות לאסוף את כל תמצית ספוגית נוזלית מלמטה לתוך הצינור הריק המתאים שכותרתו מראש.
יש להשליך את הצינור המשומש המכיל את המקלון. רכז את הדגימה ברכז ואקום, ודא שמכסה הצינור פתוח, עם סיום המחזור, ודא שהדגימה מרוכזת לחלוטין כשנותרה רק גלולה. יש לאחסן את הגלולה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
לניתוח RT-QuIC, הכינו פקדי צלחת שליליים וחיוביים עם הומוגנטים מתאימים במוח המדוללים בתמיסת דילול רקמות. כעת הפשירו את גלולת תמצית המקלון המאוחסנת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס והשהו מחדש את תמצית המקלון המיובשת עם 50 מיקרוליטר מים באיכות מולקולרית על ידי פיפט. מערבלים לזמן קצר, ומניחים לדגימה לשבת בטמפרטורת החדר.
טען שני מיקרוליטרים של בקרות צלחת שליליות וחיוביות ולאחר מכן תמציות מטוש לתוך בארות צלחת RT-QuIC בהתאמה. מקלוני בקרה שליליים לא חצו את סף הפלואורסצנטיות החיובית, ואישרו כי לא היה זיהום במהלך ההליכים. תמציות ספוגית בקרה חיוביות הציגו זריעה עקבית בכל הבארות המשוכפלות, והפגינו רגישות גילוי נאותה.
דגימות מטוש משטח מאזורים לא מזוהמים לא הראו זריעה מעל הסף, מה שאישר שליליות פריונים. משטחים מזוהמים פריון, הוצגו זריעה מעל הסף עם יחסי נקודה מקסימלית מגוונים וזמני פלואורסצנטיות בהשוואה לבקרות. משטחים מזוהמים בפריונים שטופלו באקונומיקה לא הצליחו לזרוע RT-QuIC, והדגימו חיטוי יעיל.
חלק מהממצאים על פני השטח הציגו עקומות קינטיות משתנות וזמני פלואורסצנטיות ארוכים יותר המצביעים על תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות, ככל הנראה בשל נוכחות אבק או כימיקלים שיוריים על משטח.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להערכת זיהום פריונים במסביבת מעבדה ומפרט פרוטוקול דה-קונטמינציה יעיל. בדיקת ניגוב הבטיחות לפריונים במעבדה המתוארת ניתנת להתאמה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של מעבדות שונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של פריונים
- בטיחות במעבדה
רקע
- פריונים הם חלבונים זיהומיים שיכולים להישמר בסביבה.
- השיטות הנוכחיות להערכת זיהום פריונים אינן מספקות.
- הבנת האינטראקציות של פריונים עם משטחים היא קריטית לבקרת זיהומים.
- המחקר שואף לפתח שיטה אמינה לגילוי פעילות זריעה של פריונים.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה חזקה לקביעת יעילות השבת פריונים.
- לספק פרוטוקול לדגימה באמצעות מטוש של משטחים לצורך זיהוי פריונים.
- לשפר את הבטיחות במעבדה בנוגע לזיהום בפריונים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שיטת סבוב (Swabbing) בשילוב עם RT-QuIC לדגימה ממשטחים.
- הכנת בקרות חיוביות ושליליות באמצעות הומוגנאטים של מוח.
- סוניקציה וצנטריפוגציה להכנת תמצית מהסבוב.
- אנליזת RT-QuIC לזיהוי פעילויות זריעה (seeding) של פריונים.
תוצאות עיקריות
- מטבונים של ביקורת חיובית הראו זריעה עקבית, מה שמאשר את רגישות הגילוי.
- משטחים שאינם מזוהמים לא הראו זריעת פריונים.
- משטחים מזוהמים בפריונים הראו זריעה מעל הסף.
- משטחים שטופלו במלבן ביטלו ביעילות את זריעת הפריונים.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה להערכת זיהום פריונים.
- דגימה של משטחים באמצעות מטבב יכולה לזהות באופן מהימן נוכחות של פריונים בסביבות שונות.
- נהלי דה-קונטמינציה נאותים יכולים להפחית באופן משמעותי את הסיכונים מפריונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהום קבוע של פריונים מהווה סיכון ייחודי לבטיחות ביולוגית ולתפעול בסביבות של מדעי המוח וביו-ייצור, ומאיים הן על הבטיחות התעסוקית והן על תקינות הניסויים. בדיקת ניגוב (swipe test) לבטיחות פריונים במעבדה, בשילוב עם אנליזת RT-QuIC, מאפשרת הערכה אובייקטיבית של יעילות הדיסאינפקציה וניטור סביבתי. שילוב זרימת עבודה זו תומך בהפחתת סיכונים ובביטחון רב-תפקודי בסביבות מחקר וייצור בעלות רמת הכלה גבוהה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר אימות של השבת פריונים כדי לתמוך בטיפול בטוח במודלים רלוונטיים למחלה.
- מפחית עמימות מכניסטית על ידי אישור היעדרו של פעילות זריעה (seeding) שיורית של פריונים על משטחי מעבדה.
- תומך בביטחון חיזוי בבדיקות ביולוגיות עוקבות על ידי מזעור סיכון הזיהום.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת סביבות עבודה מאושרות וחופשיות מזיהומים עבור בדיקות הגברה רגישות של פריונים.
- מסטנדרט את הניטור הסביבתי באמצעות קריאות RT-QuIC כמותיות להשגת הדירות.
- מאפשר הערכה מהימנה של פרוטוקולי דה-קונטמינציה לפני סריקה בהספק גבוה או פריסת הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי הבטחת בטיחות ביולוגית במערכות הרלוונטיות למחלה.
- מפחית את הסיכון לזיהום צולב שעלול להטעות מחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים או נקודות סוף פרה-קליניות.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית למחקרים הכוללים סוכני פריון עמידים או קשורי-פנים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
תהליך העבודה של בדיקת הניגוב (swipe test) ו-RT-QuIC משלב ממשקים של בטיחות ביולוגית במעבדה, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי, ותומך הן בשלבי הגילוי המוקדמים והן בשלבי תיקוף פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאשרת אינאקטיבציה יעילה של פריונים ותומכת בבדיקת היפותזות בביולוגיה של פריונים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת מוכנות של בדיקות סביבתיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות RT-QuIC מבוססות סף להשוואת יעילות דה-קונטמינציה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מבטיחה רציפות ובטיחות ביולוגית במודלים פרה-קליניים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ברמת הארגון: קובעת פרוטוקול סטנדרטי הניתן לשימוש חוזר לצורך ניטור שוטף של המעבדה והמתקן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי עבודה של מחקר פריונים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ניטור בטיחות ביולוגית ותומך בהדירות בין צוותים ואתרים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה (go/no-go) של שימוש במתקנים ותכנון ניסויי, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון ובקידום תוכניות מחקר ופיתוח הקשורות לפריונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של פריונים ובהפעלת בדיקת RT-QuIC.
- נדרשת גישה לציוד ביולוגיה מולקולרית, כולל סוניקטורים ופלטפורמות RT-QuIC.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לגבי נהלי דגימה ובקרה.
- חייב להיות מותאם למבני מעבדה וסוגי משטחים שונים, כפי שנתמך בפרוטוקול.
- הפוטנציאל לתוצאות ארטיפקטואליות עקב מזהמי משטח מחייב פרשנות זהירה של קינטיקת ה-RT-QuIC.
