זרימת עבודה אופטימלית להלבנה איטרטיבית מרחיבה את ההדמיה המרובה של דגימות קליניות אוטו-פלואורסצנטיות מאוד
11 ביולי 2025
היישום של טכניקת הקרנה פוטו-ארבלית בעלות נמוכה בשיטת IBEX הידנית מאפשר הדמיה אופטימלית של רקמות אנושיות עם אוטופלואורסצנציה טבעית משמעותית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להשיג תמונות מרובות ושקופיות שלמות מדגימות קליניות בארכיון באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ריאגנטים זמינים באופן נרחב ותוכנת קוד פתוח ליישור ועיבוד תמונה.
[קריין] באמצעות פרוטאומיקה מרחבית, המכונה שיטת השנה של Nature Methods לשנת 2024, ניתן למפות את המיקומים המדויקים של תאי החיסון יחד עם אינטראקציות תא-תא בתוך רקמות. זה חושף דפוסים מרחביים הקשורים לתוצאות קליניות. בניית לוחות נוגדנים מורכבים ורקמות הדמיה עם פלואורסצנטיות אנדוגנית גבוהה מהווים אתגרי זמן, משאבים ומומחיות משמעותיים עבור IBEX וטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות אחרות. באמצעות IBEX, זוהו מאפיינים ספציפיים לגידול בחולי לימפומה זקיקית בסיכון גבוה, ועם עמיתים באטלס התאים האנושיים. נוצרה מפה מרחבית מקיפה של בלוטת התימוס האנושית. מעט ידוע על הרכב תאי החיסון, האינטראקציות המרחביות והבדלי ייצור הציטוקינים על פני פתולוגיות ריאתיות מיקובקטריאליות מגוונות. פרוטוקול זה מגשר על הפער הזה. פרוטוקול זה מציע שיטת הקרנת אור בעלות נמוכה וניתנת להתאמה להפחתה משמעותית של אוטופלואורסצנציה של רקמות בספקטרום רחב, במיוחד בדגימות FFPE קשות, תוך שמירה על אות הנוגדנים לניתוח מרחבי. כדי להתחיל, טבלו את השקופיות עם רקמה ב-PBS לאחר השלמת אחזור האנטיגן. הסר שקופית אחת מה-PBS והשתמש במגבון נטול מוך כדי לייבש בזהירות את כל המאגר העודף מבלי לגעת ברקמה. בעזרת עט הידרופובי, צייר גבול סביב קטע הרקמה בשקופית. לאחר חזרה על התהליך עבור המגלשות הנותרות, הניחו למחסומים ההידרופוביים להתייבש למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת מגבון נטול מוך, נדפו את ה-PBS מחלק הרקמה מבלי לגעת ישירות ברקמה. כעת הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם על השקופית וסגור את תא הלחות. הנח את החדר במיקרוגל מדעי שאינו מחמם עם מנגנון ויסות טמפרטורה והפעל את התוכנית שהוקמה קודם לכן חמישה מחזורים. במהלך הדגירה החוסמת, הכינו את תמיסת צביעת הנוגדנים העיקרית 1 עם ווים והמאגר החוסם המכיל בלוק Fc. שלב את הנוגדנים וערבב בעדינות את הקוקטייל. בסיום מחזור המיקרוגל, הסר ופתח את תא ההחלקה ונתף את המאגר החוסם מהמגלשה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית 1 לשקופית. החזר את התא למיקרוגל והפעל שוב את תוכנית הנוגדנים העיקרית למשך כ-30 דקות. לאחר השלמת תיוג הנוגדנים הראשוני, החזק את השקופית בצורה אנכית. כדי לשטוף את המגלשה, פיפטה 1,000 מיקרוליטר PBS על הרקמה, ואפשרה לה לברוח. הסר את עודפי ה- PBS ותקן את השקופית עם 1% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתא הלחות. לאחר הקיבוע, שטפו את השקופית היטב עם 1,000 מיקרוליטר PBS שלוש עד חמש פעמים והשאירו שכבה של PBS על הרקמה עד לשלב ההקרנה. להכנת קופסת הקרנת האור, אספו מנורת לד של 150 וואט, מנורת LED הצפה RGBW של 40 וואט, מיכל פלסטיק גדול בנפח 75.71 ליטר ומעלה, PBS טרי וצלחת פטרי. כעת מלאו את צלחת הפטרי ב-1x PBS כדי להטביע לחלוטין את המגלשה. בצע את הליך הקרנת האור בחדר קר כדי למזער את החום מהמנורות. לאחר מכן הניחו את השקופית בצלחת הפטרי, וודאו שהיא שקועה במלואה ב-PBS. לאחר מכן, הנח את ה-40 וואט lamp ישירות מעל צלחת הפטרי כשמקור האור פונה כלפי מטה לכיוון המגלשה והגדר את המנורה למצב אור אדום. לבסוף, הפעל את מנורות ה-150 וואט וה-40 וואט וכסה את כל ההתקנה במכסה מיכל הפלסטיק. לאחר שעתיים, העבר את המנורה לאור ירוק ודגר למשך 16 שעות. הפלואורופורים הבהירים ביותר התואמים לפרוטוקול השבתת הצבע זוהו והוצמדו לסמנים בעלי ביטוי נמוך כדי לשפר את זיהוי האותות. האוטופלואורסצנציה הופחתה באופן משמעותי לאחר הקרנת אור, ובאורכי גל הדמיה ארוכים יותר. נוגדנים מצומדים ישירות המכוונים לסמנים מבניים בעלי ביטוי גבוה, אקטין שריר חלק אלפא ופאן ציטוקרטין, שהוחלפו בתעלת האינפרא אדום הקרובה ב-750 ננומטר. אות הרקע הופחת באופן חישובי באמצעות תמונת ייחוס לא מוכתמת ואריתמטיקה של SimpleITK, ואותות אמיתיים שופרו באמצעות סף. הדמיית שקופיות שלמה של קטעים מוכתמים ב-IBEX חשפה גרנולומות עם ליבות נמקיות ונויטרופילים חיוביים ל-CD15. מיקובקטריום טוברקולוזיס או מיקובקטריות שאינן שחפתיות זוהו ליד הליבה הנמקית של הגרנולומה באמצעות נוגדן אנטי-אנטיגן 85B. רקמת לימפה הקשורה לגרנולומה הכילה תאי B חיוביים ל-CD20, תאי T חיוביים ל-CD4, כמה תאי T חיוביים ל-CD8 ותיוג CD45 של כל תאי החיסון בריאה. הדמיית IBEX אפשרה גם הדמיה של מאפיינים אנטומיים של הריאות, כולל תאי אפיתל של הסימפונות, שריר חלק עורקי ומקרופאגים חיוביים ל-CD68.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת הקרנה פוטונית בעלות נמוכה המשפרת את הדימוי של רקמה אנושית בעלת פלואורסצנציה עצמית טבעית. הפרוטוקול מאפשר דימוי רב-ערוצי של נתחים שלמים מדגימות קליניות מאוכלסנות, תוך שימוש בריאגנטים זמינים ובתוכנה בקוד פתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- אימונולוגיה
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- פרוטאומיקה מרחבית מאפשרת מיפוי של תאי חיסון והאינטראקציות שלהם בתוך רקמות.
- קיימים אתגרים בבניית פאנלים של נוגדים ובדימוי של רקמות בעלות פלואורסצנציה אנדוגנית גבוהה.
- טכניקת IBEX מזהה מאפיינים ספציפיים לגידול אצל חולי לימפומה בסיכון גבוה.
- מעט ידוע על הרכב תאי החיסון בפתולוגיות ריאתיות מיקובקטריאליות.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול להפחתת אוטופלורסצנציה של רקמה תוך שימור אותות הנוגדנים.
- סיוע בניתוח מרחבי של תאי מערכת החיסון בדגימות רקמה מורכבות.
- גישור על פערי ידע באינטראקציות בין תאי מערכת החיסון בפתולוגיות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שקופיות עם רקמה נטבלות ב-PBS לאחר שלב חשיפת האנטיגן.
- מכינים וממריצים תמיסות של באפר חסימה (Blocking buffer) ונוגדן ראשוני.
- ביצוע הקרנה פוטונית באמצעות נורות LED ספציפיות להפחתת פלואורסצנציה עצמית.
- ביצוע דימוי של השקופית כולה (Whole-slide imaging) להדמיית אינטראקציות בין תאי מערכת החיסון ומאפייני הרקמה.
תוצאים עיקריים
- הושגה הפחתה משמעותית באוטופלורסצנציה לאחר הקרנה פוטונית.
- גרנולומות וסוגי תאי מערכת החיסון הודגמו ברקמת ריאה.
- נוגדנים ספציפיים זיהו Mycobacterium tuberculosis בקרבת גרעינים נמקריים.
- דימות IBEX חשף מאפיינים אנטומיים מפורטים של רקמות ריאה.
מסקנות
- הפרוטוקול משפר את הדימיון של רקמות מורכבות תוך מזעור של פלואורסצנציה עצמית.
- הוא מספק כלי בעל ערך לחקר אינטראקציות של תאי מערכת החיסון במחלות שונות.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון רחב של יישומים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי רב-ערוצי (Multiplexed imaging) של דגימות קליניות בעלות אוטופלורסצנציה גבוהה מהווה צוואר בקבוק מתמשך במחקר תרגומי, המגביל את היכולת להבחין בפנוטיפים מרחביים של תאי מערכת החיסון ברקמות מאוכלסות. תהליכי העבודה האופטימליים של IBEX, הכוללים הבהרה (bleaching) וקרינה פוטונית (photoirradiation) איטרטיבית, נותנים מענה ישיר לאתגר זה, ומאפשרים פרוטאומיקה מרחבית כמותית ברזולוציה גבוהה בדגימות FFPE באמצעות מכשור נגיש. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ותומכת בגילוי עמיד של סמנים ביולוגיים במערכות מגוונות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי פנוטיפי עמוק של אוכלוסיות תאי חיסון בתוך ארכיטקטורה רקמתית שלמה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת קשרים מרחביים ואינטראקציות בין תאים בהקשרי מחלה.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות קריאות כמותיות ומרובות (multiplexed) בדגימות רלוונטיות קלינית.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין חתכי רקמה מאומתים עם אוטופלורסצנציה נמוכה עבור תהליכי הדמיה מולטיפלקסית בהמשך השלב.
- משפר את השחזוריות של הבדיקה ואת הגילוי הכמותי של האות על ידי מזעור הפרעות הרקע.
- מאפשר הדמיה ניתנת להרחבה של השקף כולו עבור סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של סממנים חיסוניים ומבניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי הפרוטאומיקה המרחבית לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של מחלות ריאה ומחלות זיהומיות.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח של דגימות קליניות מאובססות.
- תומך בקבלת החלטות לגבי קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות אספקת נתונים בעלי תוכן גבוה ורזולוציה מרחבית מדגימות מאתגרות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
תהליך עבודה זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לביצוע פרוטאומיקה מרחבית ברקמות FFPE, ובכך הוא תומך הן במחקרים מכניסטיים מוקדמים והן בתיקוף של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות פרופיל חיסוני בעל רזולוציה מרחבית.
- סריקה: מספקת תוצרי דימוי Multiplexed כמותיים וניתנים לשחזור המתאימים לניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מספקת נתונים בעלי תוכן גבוה מכל השקף להשוואה סטטיסטית חסונה של התפלגויות תאי חיסון ומאפייני רקמה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לסנכרון של סממנים ביולוגיים בדגימות קליניות מאומתרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול דימוי בעל יכולת התאמה רחבה לסוגי רקמות ומודלי מחלה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בפרופיילינג חיסוני מרחבי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה בדימות ומשפר את השחזוריות בין סוגי דגימות שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות ליצירת נתונים אמינים מדגימות מאוחסנות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות גילוי ותרגום קליני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון פאנל נוגדנים ובדימוי פלואורסצנציה.
- דורש גישה למיקרוסקופיה בשדה רחב (widefield microscopy) ולתשתית להקרנה פוטונית מבוססת LED.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור תיקוף נוגדנים ותהליכי עבודה של ניתוח תמונות.
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות FFPE שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור מטריצות דגימה שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות אובדן אפיתופים פוטנציאלי וחפיפה ספקטרלית, מה שמחייב תכנון ותיקוף קפדניים של הפאנל.
