פרוטוקול מעודכן להרכבה ושימוש במערך המיני-ביו-ריאקטור (MBRA)

לכן המחקר שלנו מתמקד במיקרוביום המעי, במיוחד כיצד ניתן להנדס אותו כדי למנוע קולוניזציה של פתוגנים מזיקים. במקביל, אנו מעוניינים גם להבין את הכללים והמנגנונים האקולוגיים מאחורי ההתנגדות הזו לקולוניזציה. טכנולוגיות, כגון ריצוף מהדור הבא, ביואינפורמטיקה מתקדמת, עכברים נטולי חיידקים ומודלים של מעיים במבחנה, כולם משנים את האופן שבו אנו חוקרים קהילות מיקרוביאליות ואת תפקידן בבריאות ובמחלות.

אחד האתגרים הגדולים ביותר במודלים של מעיים במבחנה הוא הפעלתם בתפוקה גבוהה. מה שאנחנו צריכים זה מערכות שמאפשרות חקירה פונקציונלית של קהילות מיקרוביאליות בקנה מידה גדול. מערך המיני-ביו-ריאקטור הוא מערכת תרבית זרימה רציפה שתוכננה לטפל בחוסר יכולת תפוקה במערכות אחרות.

זה מאפשר לנו להרחיב את הניסויים תוך לכידת התנהגות מורכבת וניתנת לשחזור של קהילת המיקרואורגניזמים. כדי להתחיל, ודא שרצועות מערך המיני-ביו-ריאקטור מודפסות בתלת מימד ומכילות שישה תאי ביו-ריאקטור עצמאיים. מסדרים את כל הרכיבים הנדרשים להרכבה.

שימוש בברז 1/4 אינץ' 28 שבר NF עם מפתח ברז עם ידית T. השחילו את שלוש היציאות בגודל 1/4 אינץ' בכל תא כדי להכניס אביזרים. לאחר שטיפת החדר במים, הניחו מוט ערבוב מגנטי בגודל 10 על 3 מילימטר לכל תא והוסיפו מיליליטר מים מזוקקים.

לאחר מכן מקם מכונת כביסה מגומי על גבי כל יציאה של הביוריאקטור. עבור כל תא, הברג פיתיון זכר מושחל אחד בקש מדיה, פיתיון זכר מושחל אחד בקש פסולת, ופיתיון זכר מושחל ריק אחד לתוך היציאות. כעת הכנס שש מחיצות גומי על דוקרני פיתוי נקבה בגודל 3/32 אינץ' וקפל את השרוול העליון של כל מחיצה כלפי מטה כדי לכסות את הצוואר.

חבר אותם ליציאות המיועדות של כל תא. חותכים רצועות צינורות C-flex באורך ובמספר הרצויים. חבר דוקרני פיתיון נקבה בגודל 1/8 אינץ' לקצה אחד ומחבר נעילת פיתוי זכר לקצה הנגדי של כל אורך צינור.

לאחר מכן הכנס דוקרני פיתוי נקבה בגודל 1/16 אינץ' לכל קצה של צינור ה-E-lab האדום בעל שתי עצירות בקוטר פנימי של 1.14 מילימטר, ואת צינור ה-E-lab הכתום בעל שתי עצירות בקוטר פנימי של 0.89 מילימטר. חבר את צינורות ה-E-lab המוכנים לצינורות C-flex וודא שכל אחד מששת אורכי צינורות ה-C-flex מחובר לקו E-lab אדום אחד וכתום אחד באמצעות פתיונות נקביים. לאחר מכן, חתוך את צינור ה-C-flex לאורכים שונים לפי הצורך.

חבר דוקרני פיתוי נקבה בגודל 1/8 אינץ' ומחבר נעילת פיתוי זכר לשני הקצוות של חתיכה אחת בגודל 3 אינץ' ולחתיכת צינור C-flex בגודל 12 אינץ'. חבר מחברי נעילת פיתוי זכר לשני הקצוות של החלקים הנותרים. הרכיבו את עץ קו הפסולת לפי תרשים התלת מימד.

חבר את הקצוות החשופים של צינורות ה-E-lab האדומים הדו-עצירות למנעולי הפיתוי הזכריים הטרמינליים בעץ קו הפסולת בסדר עולה בהתבסס על אורך צינורות C-flex. לאחר מכן חבר את צינור ה-C-flex בגודל 3 אינץ' עם דוקרני הפיתוי הנקביים בגודל 1/8 אינץ' ומחבר נעילת הפיתוי הזכרי לחלק העליון של עץ קו הפסולת. הרכיבו את עץ קו ההזנה לפי תרשים התלת מימד.

גשר את הקצוות החשופים של צינור ה-E-lab הכתום בעל שתי עצירות למנעולי הפיתוי הזכריים הסופיים בעץ קו ההזנה בסדר עולה בהתבסס על אורך צינור C-flex, והצמד את צינור ה-C-flex בגודל 12 אינץ' לחלק העליון של עץ קו ההזנה. חבר את צינור ה-C-flex באורך משתנה בקצה עץ קו ההזנה לביו-ריאקטור, וסדר אותם בסדר עולה מהקו הקצר ביותר משמאל לארוך ביותר מימין. חבר את צינור ה-C-flex באורך משתנה בקצה עץ קו הפסולת לרצועת הביוריאקטור בסדר יורד עם הקו הארוך ביותר משמאל והקצר ביותר מימין כדי להתאים למיקום המשאבה.

צרור את כל קווי ההזנה של C-flex יחד בצד שמאל של הרצועה ואבטח אותם עם עניבת טוויסט. צור לולאה עם צינורות ה-E-lab הכתומים הדו-עצירות בין קווי ה-C-flex ואבטח את הלולאה באמצעות סרט חיטוי, וחזור על התהליך עבור צינורות ה-E-lab האדומים הדו-עצירות בצד הפסולת של רצועת הביוריאקטור. מכסים את הפיתוי הנקבי בקצה הפסולת ומאכילים עצים בנייר כסף כדי למנוע זיהום.

שחרר את פתיונות ההברגה הזכריים עם מחיצות בכל תא ביו-ריאקטור כדי לאפשר לאדים לברוח במהלך החיטוי. לאחר הנחת המכלול בפח חיטוי, מתחו את עצי קו ההזנה והפסולת לפחים נפרדים הסמוכים לזה המכיל את רצועות ה-MBRA. כדי לחבר את המערכת למשאבות, הסר את סרט החיטוי המאבטח את צינורות ה-E-lab הן עבור פסולת והן עבור קווי הזנה, ושחרר את צרורות צינורות C-flex.

מקם את ה-MBRA בין שתי המשאבות על גבי צלחת הערבוב. מהדק אותו באמצעות המחזיקים המודפסים בתלת מימד ויישר אותו עם עמדות הערבוב המסומנות על הצלחת. כעת חבר את צינור ה-E-lab של קו ההזנה למחסניות המשאבה הפריסטלטית ומקם את עצירות הצינור בחריצי המחסנית.

חזור על התהליך עבור צינור המעבדה האלקטרונית של קו הפסולת על המשאבה הממוקמת מימין לצלחת הערבוב. לאחר מכן נעל את מחסניות המשאבה הפריסטלטית לתוך המשאבה. סדרו את צינורות ה-C-flex בצורה מסודרת באמצעות מחזיקי הצינורות המודפסים בתלת מימד.

חבר את קצה עץ קו הפסולת לצינור המחובר לבקבוקי הפסולת. לאחר מכן, חבר את הפיתוי הנקבי על צינור הכניסה של קו ההזנה למחבר הזכר בצינור ה-12 אינץ' מכובע בקבוק המדיה. הפעל את שתי המשאבות כדי להתחיל את זרימת המדיה וודא ששתי המשאבות מוגדרות לסיבוב בכיוון השעון כאשר הפסולת ממוקמת מימין למשאבות.

שימו לב לגודל הטיפות ולקצב בכל תא ביו-ריאקטור. אם מבחינים בשונות או חריגה כלשהי, החלף את צינור ה-E-lab הכתום בעל שתי הפסקות המחובר לתא הפגוע כדי להפחית את שינוי קצב הזרימה. לאחר שהתאים מלאים, כבה את שתי המשאבות ואפשר לביו-ריאקטורים לשבת במשך 24 עד 48 שעות כדי לבדוק אם יש זיהום לפני תחילת הניסוי.

העבר את כניסת המדיה למיכל ליטר אחד של 10% אקונומיקה במים נטולי יונים והגדל את קצב הזרימה בשתי המשאבות למקסימום כדי לעקור את תכולת תאי הביוריאקטור עם אקונומיקה. לאחר שהתאים נקיים ממדיה, הפוך את ה-MBRA לחיטוי מעל קו המילוי למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, יש לתקן את המערכת ולהמתין חמש דקות נוספות לעיקור.

לאחר שהתאים נוקו ממדיה ועברו עיקור במשך 10 דקות, החליפו את האקונומיקה בליטר אחד של מים נטולי יונים ושטפו את המערכת עד שהמים עברו. לאחר מכן נתק את צינורות ה-E-lab של הביוריאקטור מהמשאבות והסר את ה-MBRAs. הסר את המחיצה המשומשת מהביו-ריאקטור ונקז כל תא עד שיישאר רק מיליליטר אחד של מים.

החלף את המחיצות, את צינורות ה-E-lab הכתומים הדו-עצורים, ובצע חיטוי של הרצועה המורכבת לחלוטין כפי שהודגם קודם לכן. לאחר שלושה מחזורים של שימוש חוזר, בצע את השלבים הבאים. דגימת צואה אנושית הוכנה וגדלה במערכת MBRA.

לאחר ארבעה ימים של זרימה רציפה, הקהילה המיקרוביאלית בכל תשעת הביוריאקטורים נשלטה על ידי 18 סוגי חיידקים, שכל אחד מהם מהווה לפחות 2% מהשפע היחסי בכל שכפול. 22 מתוך 65 הסוגים שזוהו היו נוכחים בכל תשעת החזרות הביוריאקטור, מה שמדגים יכולת שחזור גבוהה. ניתוח גיוון אלפא הראה שונות מינימלית בין שכפולים הן ביחידות הטקסונומיות התפעוליות שנצפו והן במדד הגיוון של שאנון.