מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

המחקר שלנו מתמקד במחלה הפוגעת בתינוקות רגישים רפואית הנקראת אנטרוקוליטיס נמק. מטרתנו לחשוף את המנגנונים המעורבים בתגובה החיסונית ב-NEC ולפתח אסטרטגיות לאבחון מוקדם ומניעה של המחלה. מאתגר מאוד לחקור תגובות תאי חיסון במעי ב-NEC יילודים. הפרוטוקול שלנו ממלא את הפער הזה על ידי הדגמת אופן בידוד תאי החיסון מסוג lamina propria לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה.

כדי להתחיל, רכוש תרבית של חיידקי אנטריים שגודלו מתינוק עם אנטרוקוליטיס טוטאליס נמק, או NEC. ביום הניסוי 0 בשעה 15:00, הפיפטה של אליקו של 20 מיקרוליטר של התרבית לצינור תרבית בנפח 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר מרק לוריה-ברטני. דגרו את תרבית החיידקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות בשייקר אורביטלי שמוגדר על 1G, תוך שמירה על מכסה הצינור במצב אוורור.

במקביל, דגרו צינור תרבית שני המכיל רק 2 מיליליטר של מרק Luria-Bertani כבקרה כדי לבדוק זיהום. למחרת, בשעה 7:00 בבוקר, פיפטה של 125 מיקרוליטר מהתרבית החיידקית הלילית לתוך בקבוק תרבית תאים T75 עם מכסה מאוורר המכיל 25 מיליליטר של מרק לוריה-ברטני. הכינו בסך הכול ארבעה בקבוקי T75 ודגרו במצב זקוף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בסולם מסלול שממוקם ב-1G.

בשעה 9:00 בבוקר בימים ניסיוניים 1, 2 ו-3, שלבו 16 מיליליטר תחליף תינוקות עם 8 מיליליטר חלב גורים בצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 50 מיליליטר להכנת תערובת הפורמולה. הסר את הסופרנטנט משני צינורות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר המכילים את תרבית החיידקים הכדורים. החזירו היטב כל אחד משני הכדורים ב-2 מיליליטר של תערובת הפורמולה המוכנה.

לאחר מכן מעבירים את שתי התערובות המוחזרות לתערובת הנוסחה שנותרה ליצירת סך של 24 מיליליטר של נוסחת NEC. תייג שישה צינורות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר עם שש נקודות זמן האכלה. פיפט 4 מיליליטר של נוסחת NEC לכל אחד מששת הצינורות המסומנים.

לאחר מכן, הכינו שישה אליקוטים חד-פעמיים של חומר ליפופוליסכריד במינון 5 מיליגרם למיליליטר ואחסנו במיקרו-צינורות בעלי חיבור נמוך בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. רגע לפני האכלה, יש להפשיר ליפופוליסכריד אחד ו-Vortex למשך 15 שניות. הוסיפו נפח מחושב של הליפופוליסכריד לצינור נוסחה NEC בנפח 4 מיליליטר וערבבו היטב על ידי פיפטינג.

מלא מזרק של 1 מיליליטר בנוסחת NEC המוכנה וחבר אותו לקו PICC ליילודים. כדי להעניק את נוסחת NEC לכל גור באמצעות גוואג' אוראלי, הרסן בעדינות את הגור בעור הרפוי בבסיס הצוואר והחזיקו אותו זקוף. מרחק ההחדרה של קו PICC שווה למרחק מפינת הפה ועד לחלק העליון של נקודת החלב בקיבה.

נקודת ההכנסה האופטימלית בקו PICC צריכה להיות מסומנת באמצעות סמן קבוע. באמצעות מלקחיים, הנח את קו ה-PICC אל האורופרינקס ומטה אל הקיבה. אם יש התנגדות, הסר את קו ה-PICC, מקם אותו מחדש ונסה להחדיר מחדש.

לשחרר 80 מיקרוליטר של פורמולה NEC באיטיות לקיבה. עקבו אחרי הגור לסימני שאיפה בזמן האכלה. לאחר האכלה, הסר את קו ה-PICC וצפה בגור לאיתור נשימה או הקאות כבדות.

אם מתרחשת הקאה, יש לנגב את הפה והאף של הגור באמצעות מגבון מעבדה עם סיבים נמוכים. חזור על תהליך ההאכלה בכל נקודות זמן האכלה. ביום הניסוי הרביעי, יש להשיג את רקמת המעי מעכברים יילודים שהושמדו.

עם זוג מספריים, חתכו את המעי לאורך כדי לפתוח אותו, ואז חתכו אותו לרוחב לקטעים בגודל 1-1.5 סנטימטר. העבר את מקטעי המעי לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תמיסת עיכול מוקדמת שקרה על קרח. לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב רציף במשך 20 דקות כדי להתחיל את פירוק הרקמות.

סובבו בעדינות את הצינור כדי לשחרר רקמה רופפת, ואז שפכו את התכולה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר המונחת מעל צינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר. העבר את חלקי הרקמה שנותרו לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר תמיסת עיכול מחוממת מראש ל-37 מעלות צלזיוס. דגרו את הדגימה בסיבוב רציף במשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן העבר את התכולה לצינור דיסוציאציה אוטומטי של רקמות. הרץ את התוכנית עם ארבעה מחזורי סיבוב של 15 שניות לסירוגין בכיוון השעון ונגד כיוון השעון. כאשר הדיסוציאציה מסתיימת, יש לסחרר בעדינות את תליית התא בצינור הדיסוציאציה ואז לבצע צנטריפוגה ב-300G למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

שאף בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. החזירו את התאים ל-1 מיליליטר של בופר מיון תאים מופעל על ידי פלואורסצנציה קרה. הניחו מסננת תאים 100 מיקרומטר מעל צינור צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר.

העבר את התאים התלויים דרך המסננת ושוטף אותם עם 2 מיליליטר של בופר מיון תאי מופעל על ידי פלואורסצנציה קרה. ספרו את התאים המבודדים והערכו את הקיימות באמצעות צבע כחול טרייפן או צבע חיות. צנטריפוגה את הנפח הרצוי לציטומטריית זרימה ב-300G למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

נצפתה ירידה משמעותית בהישרדות בקבוצת הטיפול ב-NEC בהשוואה לקבוצת הביקורת שהוזנו מדם. בדיקת המעי הכללי של עכברי NEC הראתה תכונות מובחנות של NEC, כולל סימנים נראים לעין של נפיחות, הצטברות אוויר ופנאומטוזיס מעי בהשוואה לביקורת בריאה. כתמי המטוקסילין ואיוזין חשפו הרס נסיסים חלקי והפרעה במבנה המעי בעכברי NEC לעומת סיסים שלמים בעכברי הבקרה.

הביטוי של RNA שליח IL1B, CXCL2 ו-LCN2 היה גבוה משמעותית בקבוצת NEC מאשר בקבוצת הביקורת. סך כל תאי החיסון CD45+ בלמינה פרופרית המעי לא היו שונים באופן מובהק בין קבוצות NEC לקבוצת הביקורת. רמות המקרופאגים היו גבוהות באופן משמעותי במעי NEC בהשוואה לביקורת.

עכברי NEC הראו שיעור מוגבר של תאי מיאלואידים, במיוחד מונוציטים ומאקרופאגים, בהשוואה לתת-סוגים חיסוניים אחרים. גישות מולטיאומיקס חד-תאיות חושפות חתימות תאי חיסון ב-NEC, ומציעות תובנות חדשות לגבי מנגנונים וסמנים ביולוגיים פוטנציאליים. מידול NEC הוא מאתגר כי המחלה היא רב-גורמית.

שכפול הסביבה המעשית האנושית, התגובות החיסוניות וההשפעות המיקרוביאליות בעכברים יילודים דורש אופטימיזציה מדויקת. המודל שלנו משלב מיקרוביום שמקורם באדם, היפוקסיה והאכלה בפורמולה, מה שהופך אותו לרלוונטי פיזיולוגית ומותאם לפרופיל תאי חיסון מפורטים בעכברים יילודים.