כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

המעבדה שלנו חוקרת את תפקידן של תאי NK (תאי זבחים טבעיים) בבריאות ובמחלה, במטרה לרתום את פוטנציאלם לשיפור הטיפולים בסרטני דם וגידולים מוצקים. בדיקות ציטוטוקסיות קיימות של תאי NK אינן סטנדרטיות בין פלטפורמות והגדרות שונות. פרוטוקול זה מספק שיטות הדימיון של תאים חיים (live-cell imaging) וציטומטריה של זרימה הניתנות לשחזור לצורך הערכה מדויקת של הציטוטוקסיות.

כדי להתחיל, הכינו 10 milliliters של 2x SYTOX Orange על ידי דילול של תמיסת Stock של SYTOX Orange לתוך מצע תרבית של NK-92 בתוך מבחנה לצנטריפוגה עם תחתית קונית של 15-milliliter. ספרו את תאי המטרה באמצעות Luna Counter לאחר ערבוב עם Trypan Blue, או השתמשו בכל שיטת ספירה של תאים המבוססת על דחיית צבע (dye exclusion) שעברה תיקוף. העבירו את הכמות הנדרשת של תאי המטרה למבחנה לצנטריפוגה עם תחתית קונית של 15-milliliter.

סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את העל-מנשאי. לאחר מכן, השביו את תאי המטרה לריכוז סופי של 250,000 תאים למילליטר במדיום 2X SYTOX Orange. להכנת תאי האפקטור, העריכו את חיוניותם וריכוזם של תאי NK-92, והמשיכו רק אם החיוניות גבוהה מ-80%, שכן חיוניות נמוכה יותר עלולה להשפיע על ביצועי הבדיקה.

ספרו והעבירו את מספר תאי ה-NK-92 הנדרש לשפופרות צנטריפוגה נפרדות בעלות תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, השעיו שוב את התאים לריכוז סופי של 500,000 תאים למיליליטר. הכינו דילול של תאי אפקטור על ידי הוספת 240 מיקרוליטר של תאי אפקטור לבארות של פלטת 96 בארות בעלת תחתית עגולה עבור יחס של שני תאי אפקטור לתא מטרה אחד, והוסיפו 120 מיקרוליטר של מצע לבארות הנותרות.

בצעו דילולות סדרתיות פי שניים מיחסי אפקטור למטרה של 2:1, 1:1 ו-0.25:1, תוך ערבוב יסודי על ידי פיפוט לפחות חמש פעמים והחלפת טיפים בין ההעברות. לאחר מכן, כדי להקים את התרבית המשותפת (co-culture), השתמשו בלוחית 96 בארות בעלת תחתית שטוחה מצופה בפוליליזין. מיד לפני ההעברה, השהו מחדש באופן יסודי את תאי המטרה ואת תאי האפקטור ללא יצירת בועות, ולאחר מכן הוסיפו 100 µL מכל תרחיף תאים לבארים המתאימות.

לאחר מכן, הוסף 200 µL של PBS לבארים הלא נעשה בהן שימוש שסביב. סבב את הפלטה בצנטריפוגה ב-100G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הפלטה במערכת לדימוי תאים חיים.

רכשו תמונות בכל שעה למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide. ודאו את איכות התמונה לאחר הסריקה הראשונה והתאימו את הגדרות הדמיה במידת הצורך. התאימו את ה-spectral unmixing כדי לתקן עבור spillover של SYTOX Orange לערוץ הירוק.

וודאו שתאים מתים חיוביים לכתום אינם מזוהים בטעות כתאים חיוביים לירוק. כדי להגדיר ניתוח של תאים שאינם דבקים על בסיס תא בודד, הגדירו את קוטר האובייקט הצפוי ל-15 micrometers כדי להתאים לקוטר התא המקורב. הגדירו את רגישות הסף (threshold sensitivity) ואת רגישות המרקם (texture sensitivity) ל-5, ואת רגישות השוליים (edge sensitivity) ל-10 כדי להקל על הפרדת מקבצי תאים.

הגדירו את טווח המסנן של שטח העצמים המקובלים ל-50 עד 2,000 square micrometers כדי להסיר פסולת ועצמים גדולים. הגדירו את המקסימום של ה-eccentricity ל-0.95 כדי להסיר עצמים שאינם תאיים. השתמשו בתאי NK אנושיים ראשוניים שגודלו במשך 16 עד 24 שעות.

העבר 500,000 תאי מטרה לשפופרת צנטריפוגה עם תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר. שטוף את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-300G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר את הנוזל העליון (supernatant). הכן תמיסת עבודה בריכוז 0.5 µM של carboxyfluorescein succinimidyl ester או CFSE ב-PBS על ידי דילול של 1 µL מתמיסת סטוק של CFSE בריכוז 5 mM לתוך 10 mL של PBS. השהה מחדש את המשקע שהתקבל בריכוז של כמיליון תאים ל-mL בתמיסת ה-CFSE.

דגרו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C, כשהם עטופים בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מאור. לאחר מכן, עצרו את התגובה על ידי הוספה של 5 עד 10 נפחים של מצע תרבית, ודגרו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר סבוב התאים בצנטריפוגה, השעיו מחדש את משקע התאים בריכוז של 250,000 תאים למילליטר, כך ש-100 µL יכילו 25,000 תאים.

הוסף 100 µL של תאי מטרה לכל באער בבאערים הייעודיים של פלטת 96 באערים בעלת תחתית עגולה באמצעות פיפט רב-ערוצי. פזר כל תנאי בשלוש חזרות. לאחר מכן, הכן 200 µL של תמיסת נוגדן בריכוז 4X בתוך מצע גידול של תאי NK עבור כל נוגדן נבדק ובקרת isotype תואמת.

העבירו את תמיסאות הנוגדנים ללוחית בארות עמוקות (deep well plate). הוסיפו 50 µL של תמיסת נוגדנים לכל בארה המכילה את תאי המטרה, וערבבו היטב על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) לפחות חמש פעמים. הוסיפו 50 µL של מצע גידול לתאי NK לכל אחת מבארות הביקורת ללא נוגדנים, וערבבו היטב על ידי שאיבה והזרקה.

דגרו את הפיתח למשך 25 עד 30 דקות בתנאי דגירה סטנדרטיים. ספרו והשיגו 200,000 NK cells והמשיכו רק אם החיוניות גבוהה מ-75% או שווה לה. השהו מחדש את התאים בריכוז של 250,000 תאים למטרבליליטר ב-800 µL של מצע תרבית לתאי NK אנושיים ראשוניים. הוסיפו 50 µL של NK cells לכל באער תואם וערבבו היטב על ידי פיפוט למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים.

בשלב הבא, העבירו באמצעות פיפט 50 microliters של מצע תרבית לכל באר בבארות הביקורת וערבבו היטב. בדקו בקפידה את פלטת 96 הבערים בעלת התחתית העגולה כדי לוודא שכל הבערים מכילות 200 microliters עם מפלס מניסקוס אחיד וללא בועות. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה למשך שתי דקות במהירות של 100G, ולאחר מכן דגרו אותה למשך 16 עד 18 שעות בתנאי דגירה סטנדרטיים.

סובב את הפלטה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300G והסר את הנוזל העליון. שטוף את כל הבארים עם 200 µL לבאר של תמיסת FACS (fluorescence activated cell sorting). הכן תערובת מאסטר (master mix) של נוגדנים פני-שטח בתמיסת FACS כפי שמוצג כאן.

שחזר את התאים ב-50 µL לכל באר של תערובת מאסטר של נוגדנים, וערבב היטב על ידי שאיבה ושחרור (pipetting) לפחות חמש פעמים. דגור את הפלטה למשך 15 דקות ב-4 °C, כשהיא עטופה בנייר אלומיניום להגנה מפני אור. הוסף 150 µL לכל באר של FACS buffer.

לאחר הצנטריפוגציה, השהו מחדש את התאים ב-100 µL לבאר של DAPI בריכוז 5 µM בבופר FACS. המשיכו מיד לרכישת הנתונים בציטומטריה זרימתית ללא דגירה לפני הרכישה. בצעו ציטומטריה זרימתית באמצעות מכשיר Cytek Aurora והקליטו את ערוצי הפלואורסצנציה עבור CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI וכל פלואורופור נוסף.

במהלך תרבית משותפת (co-culture), תאי אפקטור, תאי מטרה חיים ותאים מתים הודגמו באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים בזמן אמת. תאי CAR2 ו-CAR3 NK-92 הפגינו קינטיקת הריגה מהירה יותר מאשר תאי CAR1-NK-92, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות יותר ביחס שווה של אפקטור למטרה. הריגת תאי המטרה עלתה עם יחסי אפקטור למטרה גבוהים יותר, כולל תאי NK-92 של ביקורת, שהפגינו ציטוטוקסיות טבעית.

תאי NK-92 מסוג CAR2 ו-CAR3 הפגינו פוטנציאליות גבוהה יותר ביחסי effector to target נמוכים בנקודות זמן מאוחרות יותר. בעוד שפוטנציאליות מוגברת ביחסי effector to target בינוניים נצפתה בנקודות זמן מוקדמות יותר. שלושה פרמטרים, KR50, KT50 ו-IKI-50, הוגדרו כדי לכמת את הפוטנציאליות של תאי CAR-NK-92, את קינטיקת ההריגה ואת הביצועים הציטוטוקסיים הכוללים של אוכלוסיות effector.

הוספה של daratumumab לבדה לא הפחיתה את הישרדות תאי המטרה, מה שאישש כי לנוגדן לא הייתה השפעה ישירה על חיוניות תאי המטרה בהיע absence של תאי אפקטור. תרבית משותפת עם תאי NK לבדם הפחיתה את הישרדות תאי המטרה לכ-70%, מה שמעיד על ציטוטוקסיות טבעית בקו הבסיס. הוספה של daratumumab הפחיתה עוד יותר את הישרדות התאים לכ-37%, בקו התואם לציטוטוקסיות מוגברת בתיווך נוגדנים.

בניגוד לכך, תנאי בקרת האיזוטייפ הראו הישרדות של כ-62%, בדומה לתנאי ה-NK בלבד. דגרנולציה של תאי NK הייתה הנמוכה ביותר בקו-קלטור של תאי NK ותאי מטרה ללא נוגדן, והגבוהה ביותר בתנאי הטיפול ב-daratumumab, בכ-31%, בעוד שבקרת האיזוטייפ נצפתה דגרנולציה בינונית של כ-19%. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את הציטוטוקסיות הטבעית של תאי NK, להעריך את יכולת ההריגה של גיבוש CAR-NK את הגידול, ולהשוות את יעילות ה-ADCC של נוגדנים מונוקלונליים. שיקול מרכזי בעת ביצוע פרוטוקול זה הוא שמירה על ספירת תאים, פיפטינג וזריעה מדויקים ועקביים של תאי NK ותאי מטרה כדי להבטיח תוצאות אמינות וניתנות לפירוש.

מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בפרוטוקולים אלו כדי לחקור חמיקה חיסונית של תאי NK, להשוות רגישות של גידולים ולהעריך אימונותרפיות חדשניות המבוססות על תאי NK בסוגי סרטן שונים.