הבינוי השרשה של מערכת Microinfusion לאספקה מתמשכת של סוכני Neuroactive.
17 במרץ 2008
כפי חקירה המוח הופך מתוחכם יותר, חקירה של מבנים מוחיים המעגלים דורש שיפור רמות של דיוק רזולוציה גבוהה יותר. פיתחנו שיטה להכנת ואת ההשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח ניצול microcannula בורוסיליקט בקוטר טיפ של 50 מיקרון.
שלום, שמי מיילס קנינגהאם. יחד עם רייאן אוקונור וסידני וונג, נדגים את בנייתו של מערכת מיקרו-אינפוזיה להגשה רציפה של חומרים נוירו-אקטיביים. עבודה זו בוצעה במעבדה לשחזור עצבי בבית החולים מקליאן, בית הספר לרפואה של הרווארד.
ברצוננו להודות לקרן Sydney rbe ולנרסד על תמיכתם הנדיבה. מצאנו כי ניתן להוביל סוכנים נוירו-אקטיביים באופן מהימן לאתרים מוגדרים במוח באמצעות מיקרו-קנולה מזכוכית בורו-סיליקט שנמשחה, שקוטר הקצה שלה קטן פי 5 עד 10 מקנולות הובלה קונבנציונליות. בשקף זה, אנו מציגים קנולת אינפוזיה נפוצה מפלדת אל חלד לצד מיקרו-קנולה שייצרנו כאן במעבדה.
הפחתה זו בגודל של קנולת ההחדרה מתרגמת להפחתה דרמטית בטראומה לאזור המוח הנחקר. שיטות קונבנציונליות רבות יוצרות למעשה נגע באזור העניין או בתוכו, מה שהופך את תקפותן של כל תוצאה לבעייתית. ניתן לראות כאן בלוח A את מידת ההפרעה לאזור המקומי שנגרמה על ידי קנולה של 0.32 מילימטר, בהשוואה לקנולה של 50 מיקרון בלוח B. תמונות בהגדלה נמוכה אלו הן של דגימות רטובות של חתכי Vibram שאינם צבועים.
אותם חתכים נצבעו לאחר מכן ב-h ו-e וצולמו בהגדלה גבוהה יותר. כדי להדגים עוד יותר את ההפחתה בנזק לרקמה באמצעות המיקרו-קנולה, רכיבי מערכת המיקרו-אינפוזיה הם משאבת zet mini Osmo עם מווסת זרימה מפלדת אל-חלד שבו הוסרה האשבה. שני עד שלושה סנטימטרים של צינור פוליאתילן, מיקרו-קנולה מסיליקט BOA בהתאמה אישית, וחוט מוליך (guide wire) בכילור 28; זוהי מערכת המיקרו-אינפוזיה המורכבת ומוכנה להשתלה.
כאן נעשה שימוש במשיכה אנכית סטנדרטית של פי펫ה ליצירת מיקרו-קנולות במפרטים הרצויים. משיכות אופקיות מתאימות אף הן. צינור הסיליקט של Bora ממויצב ומאובטח על ידי שינוי טמפרטורת גוף החימום והמתח של המוט.
ניתן לשחזר באופן מהימן מיקרו-קנולות בעלות קטרים ספציפיים וקישורי גבעול ארוכים ומדורגים. צינור הסיליקה של Bora מחומם ומפעילים עליו לחץ עדין כדי להביא את כמות הכיפוף הרצויה בצינור. כיפוף זה מבוצע במרחק מקצה המיקרו-קנולה המתאים לעומק יעד המוח הרלוונטי, תוך התחשבות במרווח הנדרש מעל הגולגולת.
האורך הסופי של צינור זה בקצה המרוחק של המיקרו-קנולה, הכיפוף, הוא בערך 9 עד 10 מילימטרים. ככל הנראה לא שבע רצון מהתוצאה, ריאן מחדיר מחדש את המיקרו-קנולה כדי לבצע כיוון עדין ולהביא את זווית הכיפוף לשלמות.
השימוש בעיפרון יהלום נותן תוצאה טובה הרבה יותר. סידני מדגימה שיטה לחיתוך צינורית הסיליקט בוריה בערך חמישה מילימטרים פרוקסימלית לכיפוף, תוך כדי החזקת הצינורית בחוזקה על משטח קשיח, כאשר החלק הדיסטלי של המיקרו-קנולה חופשי להשקיע מעל הקצה. היא חורצת את הצינורית באופן היקפי.
לאחר מכן, על ידי הפעלת לחץ עדין, היא שוברת את הפביק באופן נקי בממשק החריץ. ניתן לצבוע את הקצה השקיף והדק של הקנולה בדיו קבוע כדי לסייע בוויזואליזציה. במהלך ניתוח תחת הגבהה, קצה המיקרו-קנולה נגזר באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה לקוטר הרצוי.
ניתן לאשר את קוטר הקצה באמצעות עינית או מיקרוסקופ. חוטי יישור רדיאליים מוכנים מחוט פלדת אל-חלד בבדיקה (gauge) 28, הנחתך לאורכים של כ-3 סנטימטרים. לאחר מכן, משתמשים בפינצטה כדי ליצור וו קטן בקצה כל חוט, שקוטרו כ-2 מילימטרים.
חוטי היישור מונחים בתוך צלחת פטרי יחד עם קטעים של 2 עד 3 סנטימטרים של צינור פוליאתילן בתוך המיקרו-קנולות. ניתן להרכיב את מערכת המיקרו-אינפוזיה באמצעות מכשירים הנפוצים ברוב המעבדות. פינצטות מיקרו, פינצטות רגילות, מספריים כירורגיים ותפסני המוסטט מונחים על סמרטוט כירורגי לצורך סטריליזציה.
המכשירים, רכיבי מערכת המיקרו-אינפוזיה (microinfusion), וכן מספר גיליות נייר אלומיניום, עוברים סטריליזציה באוטוקלאב סטנדרטי. מודולטור הזרימה מוצא בזהירות מאריזתו ומונח בתוך צלחת פטרי סטרילית. הוא מוחזק בבטחה בעזרת תפסני המוסטט (hemostats), והאשבה הפלסטית מוסרת מצינור המודולטור העשוי פלדת אל-חלד באמצעות מספריים.
את משאבת האוסמוזה המיניאטורית מוציאים גם היא מאריזתה ומניחים אותה בתוך צלחת פטרי סטרילית. את צינור הפלדת אל-חלד מחדירים אל תוך צינור הפוליאתיל לעומק של כשני עד שלושה מילימטרים, ואותם אוטמים יחדיו באמצעות אפוקסי המופעל על ידי אור. לעבודות עדינות אנו משתמשים ב-Lummi bond מהמעבדה לנוירולוגיה; אנו ממלאים מזרק של 1 CC ב-Lummi bond ומשתמשים במחט מדגם 27 gauge כמרכיב למריחה, ותחת אור חזק ה-Lumon מתקשה תוך שניות ספורות.
את המשאבה האוסמוטית המיניאטורית ממלאים על ידי החזקתה במצב אנכי, והזרקה זהירה של הנוזל באמצעות מחט המילוי המסופקת על ידי היצרן. אנו ממליצים לעקוב אחר נפח הנוזל המוזרק למשאבה ו/או לשקול את המשאבה לפני ואחרי המילוי כדי לוודא שהיא מלאה לחלוטין ואינה פגומה. שימו לב כי איננו ממליצים להשתמש במשאבות באופן חוזר.
לאחר מכן, מוחדר המודולטור המלא עם צינור הפוליאתילן המחובר אליו אל תוך המשאבה האוסמוטית המיניאטורית. נוזל שבתוך המשאבה יידחף אל תוך צינור הפוליאתילן עם הכנסת המודולטור הספוגי. יש לרשום את המרחק הראשוני של צינור הפוליאתילן הממולא בנוזל, ויש לצפות לעלייתו לאחר הפעלת המשאבה תחת אינקובציה ובסליין סטרילי בטמפרטורה של 39 °C לאחר 12 שעות של אינקובציה.
המשאבה האוסמוטית המיניאטורית הפעילה טבולה בתמיסות מלח סטרילית, המספקת סביבה נטולת אוויר לשלבים הסופיים של בניית מערכת המיקרו-אינפוזיה. מזרק המצויד בצינור פלסטיק בעובי דק ומלא באותו תמיסה שנמצאת במשאבה משמש להוצאת האוויר מהחלק הריק של צינור הפוליאתילן. יש לוודא כי האוויר בתוך המיקרו-קנולה הוצא.
באופן דומה, ייתכן שהקצה הדיסטלי של צינור הפוליאתילן ידרוש הרחבה מסוימת בעזרת מיקרו-פינצטה, ולאחר מכן מוכנס הקצה הפרוקסימלי של המיקרו-קנולה. כעת המערכת כולה נקייה מאוויר או מחלל מת, וניתן להוציאה מאמבט הסליין ולייבש אותה בעזרת גזה סטרילית. לאחר מכן נמרח Luma bond כדי לקבע את המיקרו-קנולה לצינור הפוליאתילן. כדי להפחית את קצב הזרימה של המיני-משאבה האוסמוטית בכשירות מחצית, שופכים פאראפין חם סטרילי לצלח פטרי קטן וטובלים לזמן קצר את החצי הפרוקסימלי של המיני-משאבה האוסמוטית.
עודפי פאראפין נספגים, ומערכת המיקרו-אינפוזיה מוחזרת לתמיסת סלין סטרילית ונשמרת עד לניתוח. רגע לפני השתלה כירורגית, תלולית המנחה מחוברת לכיפוף של המיקרו-קנולה.
הציר האורכי של תיל המוליך מיושר עם החלק של המיקרו-קנולה שייכנס לרקמת המוח ומקובע באמצעות lumon. במצב זה, ניתן למקם את מערכת המיקרו-אינפוזיה על זרוע מניפולציה של מכשיר סטריאוטקסי.
חוט המדריך מקובע באמצעות תפסן של זרוע מניפולטור, והמשאבה קשורה מלמעלה בלולאת תפר סטרילית. דבר זה יתמוך במשקלה ויאפשר ליישור מדויק של המיקרו-קנולה בניצב לפני השטח של הגולגולת על ידי כיפוף זהיר של חוט המדריך באמצעות פינצטה; לאחר מכן ניתן להשתיל את מערכת המיקרו-אינפוזיה באמצעות הליך סטריאוטקסי סטנדרטי. צינור ה-boel מקובע לפני השטח של הגולגולת באמצעות דבק.
אנו משתמשים ב-den mat Jaron כדי לעצב פדסטל (pedestal) בעל פרופיל נמוך. שארית תיל ההדרה הבולטת מעל ההכנה נחתכת לאחר מכן בקו אחת עם פני השטח של הפדסטל. באמצעות גלגל חיתוך המחובר למקדחה מהירה, ניתן להניח את המשאבה האוסמוטית המיני-אוסמוטית תת-עורית בין שכבות העור של החיה.
השיטה הנוכחית מציעה מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות. ניתן לבנות אותה בהתאמה אישית כדי להתאים למין ולגיל של בעל החיים הניסויי. ניתן לעצב את צינורית הסיליקה כך שתהיה תואמת לפני השטח של גולגולת בעל החיים.
לפיכך, על ידי מתן אפשרות לקיבוע מאובטח בפרופיל נמוך ומניעת הצורך בפדסטל קרניאלי גדול, ניתן לסגור בקלות את הפצע הניתוחי מעל פדסטל המיקרו-אינפוזיה המבני, ובכך להפחית את הסיכון לזיהום וכן את אי-הנוחות של בעל החיים, כאשר קיבוע המערכת לגולגולת דורש שטח פנים קטן יותר. לפיכך, ניתן לבצע פרוצדורות נוספות או עוקבות ללא הפרעה מפדסטל גדול יותר. עם זאת, נקודה חשובה ביותר היא ששיטה זו מפחיתה את הפולשנות ואת הטראומה לסביבה המקומית של אתר האינפוזיה, ובכך ממזערת את אפקט הצופה.
אלו הם השינויים שהתצפית הפעילה תחולל בתופעה הנצפית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להכנה ולהשתלה של מערכת עירוי כרונית בתוך המוח. תוך שימוש במיקרו-קנולה מבורוסיליקט עם קוטר קצה של 50 microns, טכניקה זו מאפשרת דיוק משופר בהחדרת חומרים נוירו-אקטיביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- הנדסת מוח
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- התקדמויות במדעי המוח דורשות שיטות מדויקות לחקר מבנה המוח.
- מערכות הובלה מסורתיות עשויות להיות חסרות את הרזולוציה הנדרשת.
- מערכות מיקרו-הזרקה יכולות לשפר את הובלתם של חומרים נוירו-אקטיביים.
- מחקר שנערך בבית החולים McLean, בית הספר לרפואה של הרווארד.
מטרת המחקר
- להדגים את בנייתו של מערכת עירוי מיקרוסקופית.
- לאפשר הזרקה רציפה של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים ספציפיים במוח.
- לשפר את דיוק ההזרקה של חומרים נוירו-אקטיביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של מיקרוקנולה מזכוכית בורוסיליקט.
- השוואה בין המיקרוקנולה לבין קנולות עירוי קונבנציונליות מפלדת אל חלודה.
- טכניקות השתלה כרונית להגשה ממושכת.
- תמיכה מבית היסוד Sydney rbe ומנרסד.
תוצאות עיקריות
- למיקרו-קניולות יש קוטר קצה הקטן פי 5 עד 10 מקניולות קונבנציונליות.
- הוכח כי הן מאפשרות הובלה אמינה של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים מוגדרים במוח.
- דיוק משופר במתן חומרים נוירו-אקטיביים.
- פוטנציאל לשיפור התוצאות במחקרים בתחום מדעי המוח.
מסקנות
- מערכת המיקרו-אינפוזיה שפותחה מייצגת התקדמות משמעותית במתודולוגיות של מדעי העצב.
- מערכות הובלה משופרות יכולות לסייע להשגת תוצאות מחקר מדויקות יותר.
- יישומים עתידיים עשויים להרחיב את השימוש במערכות מיקרו-אינפוזיה במגוון מחקרים במדעי העצב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
החדרה מדויקת של חומרים נוירו-אקטיביים לאתרים ספציפיים במוח היא קריטית לתיקוף מטרות (target validation) ולהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות למדעי העצבים. מערכת מיקרו-אינפוזיה זו מפחיתה את הפולשנות ואת הטראומה לרקמה, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים ואת הביטחון בתוצאות התרגומיות במודלים פרה-קליניים. העיצוב הניתן להתאמה אישית והפרופיל הנמוך תומכים בשימוש רחב על פני מינים שונים ומגוון עיצובי מחקר, ובכך מייעלים את תהליך מיון הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות עם השפעה מינימלית של הצופה הנובעת מטראומה כירורגית.
- ערך תפעולי: תומך בהגשה הדירה של תרכובות לצורך תיקוף של מעורבות המטרה in vivo.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספקת פלטפורמה סטנדרטית להגשה ממושכת של חומרים פעילים במחקרי תגובה למספר (dose-response).
- ערך תפעולי: מקלה על מוכנות הבדיקה באמצעות ייצור והשתלה עקביים של מיקרוקנולה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות להגשה כרונית במודלים מדויקים מבחינה אנטומית.
- ערך תפעולי: מפחית שונות הנובעת מדלקות ומגורמים מבלבלים של נגעים, ובכך משפר את הניבוי הפרה-קליני.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בביולוגיה של הגילוי באמצעות בדיקת השערות, סריקה באמצעות הובלה כמותית, ומחקר תרגומי על ידי תמיכה ברציפות טרום-קלינית תוך הפחתת רעש ביולוגי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת תיקוף מדויק של מטרות על ידי מזעור נגעים מבלבלים באזורי מוח רלוונטיים.
- סריקה: מספקת חומרים עם הדירות גבוהה, התומכת בתוצאות אמינות של סריקת תרכובות.
- אנליזה: מייצרת חשיפה כמותית של חומרים נוירו-אקטיביים, המסייעת בניתוח השוואתי של מצבים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות לתיקוף פרה-קליני על ידי הפחתת גורמים כירורגיים מבלבלים המסיחים אותות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת הניתנת לשימוש חוזר להזרקה כרונית במגוון פרויקטים של נוירו-פרמקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הפחתת עמימות מכנית הנובעת מטראומה כירורגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ייצור מותאם אישית של מיקרו-קניולות.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הגברת תוקף הנתונים במחקרי תיקוף מטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון באמצעות שיפור יחס האות לרעש בשלב הפרה-קליני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במשיכת מיקרו-פיפטות מזכוכית ועיצובן באמצעות חום.
- דורש גישה למיקרו-פורג' (microforge), למכשור סטריאוטקסי ולטכניקות עבודה אספטיות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור מימדי הקנולות ופרוטוקולי ההשתלה.
- כולל שיקולי התאמה למבני גולגולת ועומקי מטרה משתנים בין מינים שונים.
- מוגבל על ידי שלבי ייצור ידניים שעלולים להשפיע על הספיק (throughput) ללא הכשרה מודרכת באמצעות וידאו.
