Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

טכנולוגיית תרביות רקמה מצאה יישומים נרחבים בתחום הביולוגיה של התא. עם זאת, תאים בתרבית דורשים תחזוקה שוטפת כדי להישאר בריאים. כאשר התאים מגיעים למצב של התמלאות (confluency), יש לבצע להם תת-תרבית (subculture) או מעבר (passage).

אי-ביצוע פעולה זו יגרום לצמיחה מופחתת ובסופו של דבר למות התאים. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לתחזק תרביות תאים הן עבור שורות תאים נצמדות והן עבור שורות תאים תלויים. שלום, אני ריקי, כאן במעבדתו של Dr.LAN ב-Molecular Pathology Laboratories Network במזרח טנסי.

היום אני רוצה להראות לכם שתי טכניקות להעברה של תאי התליה ותאים נצמדים. כדי להעביר פלטה של תאים, נרצה להתחיל בתרבית ראשונית שגדלה עד למצב של התכנסות (confluency) בצלחת פטרי של 60 מילימטר או בבקבוק לתרביות רקמה של 25 סנטימטר רבוע המכיל 5 מיליליטר של מצע לתרביות רקמה.

נתחיל בהסרה של כל המצע מהתרבית הראשונית באמצעות פיפטה סטרילית. לאחר מכן, נשטוף את שכבת התאים הדבוקה פעם אחת או פעמיים בנפח קטן של HBSS בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ללא סידן ומגנזיום. זאת כדי להסיר שאריות של סרום עגל עוברי (fetal bovine serum) שעלולות לעכב את פעולתו של אנזים ה-trypsin שנוסיף בשלב הבא.

בשלב הבא, הוסיפו לתרבית כמות מספקת של תמיסת trypsin EDTA חמה כך שתכסה את שכבת התאים הדבקים. לאחר מכן, ניתן להניח את הצלחת על מגש חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה עד שתי דקות. לאחר הדגירה, הקשו על תחתית הצלחת על משטח שטוח כדי לשחרר את התאים.

בדקו את התרבית באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים קיבלו צורה עגולה, דבר המעיד על כך שהם ניתקו מהמשטח. אם התאים אינם מנותקים מספיק, החזירו את הצלחת למגש החממה לדקה או שתיים נוספות. לאחר הבדיקה במיקרוסקופ, שטפו את הצלחת במצע מלא והעבירו בעזרת פיפטה את התוך למבחנה קונית של 15 ml המכילה 2 ml של מצע מלא.

סובב את התאים בצנטריפוגה כדי להשקיע אותם, ותלה את המשקע במדיום מלא. כעת, הוסף נפח שווה של תגסוס תאים לכל אחת מהצלחות החדשות שסומנו כראוי. לחלופין, ניתן לספור את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer) ולדלל אותם לצפיפות הרצויה, כדי שניתן יהיה להוסיף מספר ספציפי של תאים לכל צלחת.

יש לוודא שכל צלחת מסומנת בתאריך התת-תרבית ובמספר המעבר. לאחר הוספת תרחיף התאים, יש להוסיף 1 ml של מצע טרי לכל תרבית חדשה. כעת יש להדגיר את הצלחות באינקובטור לח עם 37 °C ו-5% CO2.

לאחר דגירה של התאים למשך לילה, הוסיפו מצע טרי לצלחות והחזירו אותן ל-37 מעלות. ברגע שהצלחת הגיעה לצפיפות מקסימלית (confluency), ניתן לבצע מעבר תאים (passage) נוסף על ידי חזרה על הליך זה, ולהמשיך במעברים לפי הצורך. כעת נראה לכם כיצד לבצע מעבר תאים בתרבית סספנסיה.

אריזת תאים בתרבית סספנסיון היא פשוטה יותר מאשר אריזת תאים נצמדים. לפני אריזת תרביות סספנסיון, יש לתחזק את התאים באמצעות הזנה מדי יומיים עד שלושה ימים עד שהם מגיעים לקונפלואנסיות (confluency), מצב שבו התאים נצמדים זה לזה בסספנסיון והתווך נראה עכור בעת סיבוב הבקבוק.

לביצוע פעולה זו, הוציאו את הבקבוק עם תרחיף התאים מהאינקובטור, תוך הקפדה לא להפריע לתאים שהשקיעו לתחתית הבקבוק. באופן אסיפטי, הסירו והשליכו כשליש מהמצע מהבקבוק והחליפו אותו בנפח שווה של מצע שחומם מראש ל-37 degrees Celsius. לאחר החלפת המצע, סובבו את הבקבוק בתנועות סיבוביות והחזירו אותו לאינקובטור, המכוון ל-37 degrees Celsius ו-5%CO2.

אם יש פחות מ-15 mL של מצע בבקבוק, הדגרירו את הבקבוק במצב אופקי כדי להגביר את המגע של התאים עם המצע. אחרת, ניתן להדגריר את הבקבוק במצב אנכי בימים שבהם אינם מזינים את התרביות. בדקו אותן על ידי סיבוב הבקבוקים כדי להחזיר את התאים לתליה.

יש להקפיד לעקוב אחר שינויי צבע במצע המעידים על צמיחה מטבולית תקינה. ברגע שהתרביות מגיעות למצב של התלכדות (confluency), מה שצפוי לקרות בריכוז של כ-2.5 million cells per mil, ניתן לבצע להן מעבר (passage). פעם נוספת, הדגמנו בפניכם כיצד לבצע מעבר לתרביות תאים, הן עבור תרביות נצמדות והן עבור תרביות בתליה.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בכל הניסויים שלכם.