מכתים חלבונים ג'ל

בסרטון קודם בשם Electrophoretic Separation of Proteins, הדגמנו כיצד ניתן להפריד תערובת מורכבת של חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. בסרטון זה, נראה לכם ארבע שיטות שונות לצביעת ג'ל לצורך ויזואליזציה של מיקום החלבונים בג'ל. שלום, אני שון גאלגר מ-UVP, העובד עם מרכז הפרוטאומיקה כאן במכון ללימודים גבוהים KEG.

היום אדגים לכם מספר טכניקות לוויזואליזציה של חלבונים לאחר הפרדה באלקטרופורזה. אלו כוללות צביעת Coomassie blue, צביעת כסף, Cyro Orange ו-Cyro Ruby. לכן, נתחיל תחילה ב-Coomassie blue.

גילוי פסי חלבון בג'ל באמצעות צביעת Coomassie blue מבוסס על קישור לא ספציפי של צבע. במקרה זה, Coomassie brilliant blue G 250. בשיטה זו, חלבונים שהופרדו בג'ל פוליאקרילאמיד נשטפים באמצעות מים בדרגת טוהר גבוהה.

לאחר מכן, מיקום החלבונים מזוהה באמצעות צביעת kamasi blue על בסיס מים. סף הגילוי הוא 0.3 עד מיקרוגרם אחד לכל פס חלבון. כדי להתחיל, השתמשו בג'ל poly acrylamide שבו הופרדו חלבונים באמצעות אלקטרופורזה.

תוך כדי ערבוב איטי, הניחו את ג'ל הפוליאקרילאמיד במיכל פלסטיק מלא ב-300 milliliters של מים בדרגת טוהר גבוהה. השאירו למשך חמש דקות. השליכו את המים וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות לאחר השטיפה השלישית.

שפכו את המים וכסו את הג'ל בתמיסת צביעה של Kamasi blue למשך שעה תוך כדי ערבוב איטי. לאחר שעה של צביעה, שפכו את תמיסת הצביעה. שטפו את הג'ל קצרות על ידי הנחתו בכ-200 milliliters של מים למשך 30 דקות. בשלב זה, ניתן לשמור את הג'ל במים לצורך דימות עתידי.

ניתן לייבש את הג'ל בשלב זה כדי לשמור תיעוד קבוע של הג'ל. לשם כך, הניחו את הג'ל על שני דפים של נייר סינון Watman בעובי 3 mm וכסו את החלק העליון בניילון נצמד. לאחר מכן, ייבשו במייבש ג'ל קונבנציונלי למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של כ-80 °C.

שיטת צביעה נוספת לחלבונים היא צביעה בכסף, אותה נדגים כעת. אף ששיטת הצביעה ב- Coomassie blue היא פשוטה ומהירה יותר, צביעה בכסף רגישה באופןconsiderable יותר, עם סף גילוי של 0.3 nanograms BSA. גילוי פסי חלבון בג'ל באמצעות צביעה בכסף תלוי בקישור של כסף לקבוצות כימיות שונות בחלבון.

הפרוטוקול הבא מבוסס על ערכת הצביעה בכסף Silver Quest מבית Invitrogen. הפרוטוקול נגזר מפרוטוקול הצביעה המהירה, שנמשך כ-30 דקות, ומייצג אחת משיטות הכימיה הרבות המבוססות על ערכות לצביעה בכסף התואמות למספקטרומטריית מסות. במקרה זה, נשתמש ב-mini gel יצוק מראש מבית Invitrogen לפני תחילת הצביעה בכסף.

יש להקפיד על הרכבת כפפות בכל עת כדי למנוע זיהום מטביעות אצבעות. הניחו את הג'ל בתבנית העמידה למיקרוגל עם 100 milliliters של מים בדרגת רהיט (reagent grade water). שטפו קצרות ואז שפכו את המים.

לאחר מכן, הוסיפו 100 milliliters של חומר מקבע, המורכב מ-40% ethanol ו-10% acetic acid במים בדרגת טוהר גבוהה, וחממו במיקרוגל למשך 30 שניות. תהליך החימום במיקרוגל מקצר את שלבי האינקובציה הדרושים על ידי האצת הקישור והצביעה. בנקודה זו, הניחו את הג'ל על שייקר ונערו באיטיות למשך חמש דקות.

לאחר חמש דקות, שפכו את חומר הקיבוע, הוסיפו 100 milliliters של 30% ethanol לשטיפת הג'ל, חממו במיקרוגל למשך 30 seconds, ולאחר מכן הניחו את הג'ל על שייקר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, שפכו את ה-ethanol. כעת הוסיפו 100 milliliters של ריאגנט רגישות (sensitizing reagent), חממו במיקרוגל למשך 30 seconds, ולאחר מכן הניחו על שייקר למשך שתי דקות.

לאחר שתי דקות, שפכו את ריאגנט ההרגשה. הוסיפו 100 milliliters של מים בדרגת ריאגנט, חממו במיקרוגל למשך 30 שניות, והניחו על שייקר למשך שתי דקות. שפכו את הנוזל וחזרו על הפעולה לסך הכל שני מחזורי שטיפה.

כעת הוסיפו 100 milliliters של תמיסת צביעה, חממו במיקרוגל למשך 30 שניות וערבבו בעדינות למשך חמש דקות. לאחר חמש הדקות, שפכו את תמיסת הצביעה. הוסיפו 100 milliliters של מים בדרגת רהיט (reagent grade water), דלגו על שלב המיקרוגל והניחו ישירות על שייקר למשך 20 עד 60 שניות.

שפכו את המים והוסיפו מיד 100 milliliters של תמיסת הפיתוח, ופתחו עד להופעת פסי חלבון נראים לעין. כאשר הרקע נותר נקי, תהליך זה יארך כחמש עד 10 דקות. בשלב זה, הוסיפו 10 milliliters של תמיסת עצירה (stopper solution) למפתח כדי לעצור את הפיתוח ולהשיג את התוצאות המיטביות.

צלמו את הג'ל בהקדם האפשרי, שכן עשויים להתרחש שינויים קלים בעוצמת הצבע ועלייה באלמנטים לא ספציפיים ברקע. עם הזמן, הג'ל שאתם רואים מכיל חלבונים שיוריים לאחר electro blotting. ייבשו את הג'ל כדי לשמור תיעוד קבוע או אחסנו אותו בשקית פלסטיק אטומה. כעת, נדגים שיטה לצביעה פלואורסצנטית של ג'לים.

לצבעים פלואורסצנטיים יש מספר יתרונות על פני צביעות חלבון מסורתיות. צביעות ג'ל לחלבונים מסוג Cipro orange, אותן נפרט כאן, יכולות לזהות ננוגרם אחד עד שניים של חלבון לרצועה. רגישות זו גבוהה יותר מזו של צביעת Coomassie brilliant blue ודומה לרגישותן של טכניקות צביעה בכסף רבות.

צביעה פלואורסצנטית היא תהליך פשוט הדורש פחות זמן עבודה מאשר פרוטוקולי צביעה בכסף טיפוסיים, והיא נשלמת תוך פחות משעה. ניתן להדמות חלבונים צבועים באמצעות טרנסילומינטור UV סטנדרטי של 300 ננומטר או סורק לייזר. במקרה זה, נשתמש שוב בג'ל mini precast של Invitrogen כדי להכין ולהפריד חלבונים באמצעות SDS page.

אולם השתמשו ב-0.05% SDS במערך ההרצה (running buffer) במקום ב-0.1% SDS הרגיל, וזאת כדי להפחית את הפלואורסצנציה של הרקע. כדי להתחיל את הליך הצביעה, שפכו תמיסת צביעה פלואורסצנטית מסוג cipro orange לתוך צלחת פלסטיק קטנה המתאימה לג'ל מיני סטנדרטי אחד או שניים. השתמשו בכ-50 milliliters של תמיסת הצביעה.

חשוב לציין שיש לנקות ולשטוף היטב את כלי הצביעה לפני השימוש, שכן חומרי ניקוי עלולים להפריע לצביעה. כעת, מקמו את הג'ל בתוך תמיסת הצביעה. כסו את המכל בנייר אלומיניום כדי להגן על הצבע מאור חזק.

נער את הג'ל בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 40 עד 60 דקות. השלך את תמיסת הצביעה ולאחר מכן שטוף את הג'ל למשך פחות מדקה בעזרת 7.5% acetic acid, בכמות של כ-100 milliliters, כדי להסיר את הצבע העודף מפני הג'ל. השהה את הג'ל באמצעות דגירה למשך לילה ב-0.1% tween 20 כדי להנחית ולצלם את פסי החלבון. הנח את הג'ל המסומן פלואורסצנטית ישירות על transluminator סטנדרטי של 300 nanometer או על transluminator של אור כחול.

בשלב הבא, נדגים שיטת סמירה פלואורסצנטית חלופית, המשתמשת בצבע הפלואורסצנטי Cipro ruby. שיטת הסמירה ב-Cipro ruby תוכננה במקור לשימוש בדו-ממדי (2D page), אך הוכחה כסמירה הרגישה ביותר לג'ל חלבונים ב-SDS page חד-ממדי סטנדרטי. כדי להתחיל, העבירו את הג'ל לכלי פוליפרופילן או PVC נקי בגודל מתאים.

הדגירו את הג'ל בכמות המתאימה של צבע โปรטאין cipro ruby לג'ל ללא דילול, תוך써 ערבוב עדין ורציף במכשיר ניעור אורביטלי במהירות של 50 RPMs. כסו את הג'ל והדגירו למשך שלוש שעות לפחות. העבירו את הג'ל לכלי צביעה נקי ושטפו אותו פעם אחת בתמיסה של 10% methanol ו-7% acetic acid, לאחר מכן אספו את הג'ל והחזירו אותו למכשיר הניעור למשך 30 דקות.

כדי להפחית את הפלואורסצנציה של הרקע ולהגביר את הרגישות, הג'ל מוכן כעת לצפייה ולצילום. אני רוצה להודות לכם על צפייתכם בפרוטוקולים של היום. הצגנו בפניכם מספר הליכים שונים להדמיית חלבונים לאחר אלקטרופורזה.

חלקן רגישות מאוד, כגון צביעה פלואורסצנטית וצביעת כסף, ואחרות הן שגרתיות, כגון צביעת kamasi blue. חשוב לזכור כי טוהר הרכיבים הוא קריטי. שימוש במים מזוקקים במיוחד (ultra pure water) הוא אף הוא חשוב מאוד, כמו גם התזמון של כל אחד מהשלבים.

עליכם להקדיש לכך תשומת לב רבה כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. זהו כל הסיפור, ובהצלחה בסדרת הניסויים הבאה שלכם.