הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

שלום, אני רנדל הופמן, סטודנט לתואר שני במעבדתה של סוזן לינוס במחלקה לביולוגיה ב-MIT. היום אני אציג בפניכם את שיטת האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז עם דטרגנט חצי-דנטורטיבי, או SDD-AGE. המעבדה שלנו משתמשת בטכניקה זו כדי לסרוק פריונים וחלבונים אלגנוגניים אחרים.

הגרסה שלנו ל-SDD age היא פשוטה ואמינה וניתן להרחיבה כדי להכיל כל מספר של דגימות. עמילואידים עמידים באופן חריג לדנטורציה על ידי SDS, מה שמאפשר להפריד אותם מחלבונים אחרים באמצעות SDDH. עם זאת, לא ניתן להשתמש בנתונים מ-SDDH כשלעצמם כדי לאשר שחומר מסוים הוא עמילואיד.

כדי לעשות זאת, עליכם להשתמש בטכניקות אחרות. עם זאת בחשבון, הרשו לי להראות לכם. ניתן לבצע S-D-D-H-S-D-D-H באמצעות ציוד סטנדרטי לאלקטרופורזה אופקית של DNA.

ראשית, יש להרכיב את תבנית יציקת הג'ל. גודל המכשור יהיה תלוי במספר הדגימות שברשותכם. עבור מספר רב של דגימות, נשתמש בלוח בגודל 20 על 24 סנטימטרים, ועד ארבעה מסרקים בעלי 50 שיניים.

להכנת הג'ל, תזדקקו ל-agarose בעל חוזק ג'ל בינוני או גבוה, נמוך ב-EO, באפר 1X TAE, ותמיסת מלאי 10% של SDS. הכינו תמיסת agarose בריכוז 1.5% ב-1X TAE. מומלץ להכין את הג'ל עבה ככל האפשר כדי שתוכלו להעמיס את כמות הדגימה המקסימלית ולמקסם את הגילוי. חממו את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה של ה-agarose.

הוסיפו במהירות את תמיסתו המרוכזת של 100 XSDS ל-0.1% וסובבו את המבחנה לערבוב. אם חלק מה-agro התגבש במהלך שלב זה, המיסו אותו על פלטה חשמלית. היזהרו שלא להגיע לרתיחה.

לאחר הוספת SDS, מכיוון שהתמיסה עלולה להקציף בקלות, יש למזג אותה לתבנית היציקה בעוד היא חמה. לאחר מכן, השתמשו במסרק כדי להסיר בועות שעלולות להפריע בשלב מאוחר יותר במהלך העברת הג'ל. לאחר שהג'ל התקרר לחלוטין והתמצק, הסירו בזהירות את המסרקים והניחו את הג'ל בתוך המיכל.

טבול את הג'ל לחלוטין ב-XTAE עם 0.1%SDS. כעת ניתן להטעין את הדגימות. דגימות החלבון המשמשות ב-SDDH מוכנות בדומה לthose של SDS page, למעט שתי חריגות חשובות.

ראשית, יש להימנע מחימום הדגימות, שכן הדבר עלול לגרום לדנטורציה של האגרגטים למנומרים של חלבון. שנית, יש להקפיד על מניעת דגרדציה של החלבון. מכיוון שתנאי הדנטורציה המשמשים כאן אינם מספיקים כדי לבטל את פעילותן של כל הפרוטאוזות, אנו ממליצים להשתמש בריכוז הגבוה לפחות פי שניים מהריכוז המומלץ של תערובת מעכבי פרוטאוזות מלאה (complete protease inhibitor cocktail).

בהדגמה זו, נשתמש בליזאטים מתאי שמרים המבטאים באופן יתר חלבון מסוים הנבדק. בדרך כלל אנו משתמשים בתרביות של 2 מיליליטר שגודלו למשך לילה בלוחות של 96 בארות הזמינים מ-VWR, אך כאשר מנתחים חלבונים בריכוז נמוך, יש להשתמש בנפחי תרבית גדולים יותר.

קצרו את התאים על ידי צנטריפוגציה של התרבית ב-2000 RCF למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגציה, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את התאים על ידי השהיה מחדש במים וביצוע צנטריפוגציה פעם נוספת. לאחר הסיבוב השני, הסירו את הנוזל העליון והשהו את התאים בתמיסת פלטינג מתאימה. האנזימים בתמיסה יעכלו את דפנות התאים, מה שיאפשר לכם לפרק (lyse) את התאים ביעילות באמצעות נפח קטן של באפר ליזיס. הדגירו למשך 30 דקות ב-30 °C.

בשלב זה, שקעו את תאי הפלסטיק העודפים ב-800 RCF למשך חמש דקות. הסירו את העלון לחלוטין והשעיקו מחדש כל משקע ב-100 µL של בופר לייס (lysis buffer). לאחר מכן, כסו את הבלוק בסרט דביק ובצעו ערבול ב-vortex במהירות גבוהה למשך שתי דקות.

פעולה זו מסייעת לכל פלסטיקי הכדור לשקע את השאריות התאיות ב-4,000 RCF למשך שתי דקות. העבר בזהירות את התוצר ללוח PCR בעל 96 בארות.

בדרך כלל, אנו מנתחים מאות דגימות בבת אחת במעבדה שלנו, ולכן כדי לסייע לנו בכך אנו משתמשים במערכת לטיפול בנוזלים. במידת הצורך, קבעו את ריכוז החלבון של הליזטים. לאחר מכן, הוסיפו sample buffer בריכוז 4x לדגימות כדי להכין ליזטים המכילים sample buffer בריכוז 1x, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כעת העמיסו את הדגימות לתוך הג'ל. במידת הצורך, שמרו מחצית מהדגימות לניתוח SDS page. כמו כן, העמיסו סמני משקל מולקולרי, כולל סמנים צבועים מראש וסמן בעל משקל מולקולרי גבוה מאוד, כגון תמצית chicken flector s.

במידת הצורך, חשוב לשמור על הג'ל קריר כדי למנוע דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך, ולכן ייתכן שתרצו להריץ אותו בחדר קירור. הריצו את הג'ל במתח נמוך, פחות משלושה וולטים לסנטימטר מאורך הג'ל. הריצו את הג'ל במשך מספר שעות עד שהצבע מגיע למרחק של כסנטימטר מקצה הג'ל.

מכיוון שקומילואיד אינו עובר דנטורציה בריכוז של 2% SDS בטמפרטורת החדר, הוא יישאר שלם בעוד שקומפלקסים אחרים, כולל רוב המצברים שאינם עמילואידיים, יתפרקו בנוכחות 2% SDS. לפיכך, רוב החלבונים יהיו מונומריים וינועו במהירות דרך הג'ל, בעוד שעמילואידים בעלי משקל מולקולרי גבוה העמידים ל-SDS ינועו לאט יותר.

לאחר מכן, הג'ל יהיה מוכן להעברה. למרות שניתן להשתמש בשיטות העברה מגוונות, אנו מקבלים את התוצאות הטובות ביותר באמצעות העברה קפילרית. מכיוון שהעברה קפילרית יכולה להתאים לכל גודל של ג'ל, היא מעשית לניתוח של מאות דגימות.

ערמה של ניירות ספיגה יבשים משמשת למשיכת התמיכה (buffer) דרך הג'ל, ובכך היא משקיעה את החלבונים על גבי ממבנה ניטרוצלולוזה הממוקם בין הניירות לג'ל. יש לחתוך פיסת ניטרוצלולוזה, כגון high bond C, extra, לממדים התואמים לאלו של הג'ל. כמו כן, יש לחתוך 20 חתיכות של נייר ספיגה מסוג GBO oh four ושמונה חתיכות של נייר ספיגה מסוג GBO oh two, באותו הגודל של הג'ל.

GB 04 הוא עבה מאוד וסופג. לעומתו, GB 02 דק בהרבה ובעל מרקם עדין יותר, המבטיח מגע אחיד יותר עם הממברנה. גזרו חתיכה נוספת של GB 04 לשימוש כפתיל, כך שתהיה רחבה בכ-20 סנטימטרים מהג'ל הטבול.

הניחו UL WIC ניטרוס וארבעה חתיכות GBO oh two ואחד XTBS במיכל פלסטיק והרכיבו ערימה של ניירות באופן הבא: 20 חתיכות של GBO oh four יבש. לאחר מכן ארבע חתיכות של GBO oh two יבש. לבסוף חתיכה אחת של GBO oh two שהורטבה מראש.

הניחו את הניטרוצלולוז על גבי ערימה זו. שטפו את הג'ל שבתבנית היציקה קצרות במים כדי להסיר עודפי תמיסת ריצה (running buffer). לאחר מכן, התחילו להחליק בזהירות את הג'ל מהתבנית אל הערימה, תוך כדי הרטבת הממברנה ב-TBS לפי הצורך בזמן החלקת הג'ל מהתבנית.

הבופר הנוסף עוזר למנוע מלכוד של בועות בתוך הג'ל. פיפטה להעברה מתאימה למטרה זו לאחר שהג'ל הועבר במלואו למערך הערימה. יש לבדוק ביסודיות אם קיימות בועות.

הרימו את קצה הג'ל והחילו שוב תמיפת בופר עד להסרת כל הבועות. הניחו את שלושת חלקי ה-GBO שנותרו, לאחר שהורטבו מראש, על גבי הג'ל. הבטיחו מגע מלא בין כל השכבות על ידי גלגול חזק של פפטה מעל פני הערימה.

הקיפו את ערימת ההעברה בשתי מגשים מוגבהים המכילים TBS והניחו את הפתיל הרטוב מעל הערימה, כך שכל אחד מקצות הפתיל טבול בנוזל. כסו את ערימת ההעברה המורכבת במגש פלסטיק נוסף שמעליו מונח משקולת, כגון בקבוק מים של 500 מ"ל, בתוך TBS. הפתיל יספוג באפר מהמגשים וניירות הספיגה היבשים ימשכו את הבאפר דרך הג'ל לאורך מספר שעות.

פעולה זו תשקיע את החלבונים על הממברנה; יש להניח להעברה להימשך לפחות שלוש שעות או למשך הלילה. לאחר השלמת ההעברה הקפילרית, ניתן לעבד את הממברנה בשיטת western blotting סטנדרטית. כאן ניתן לראות blot טיפוסי של חלבונים שהביטוי שלהם היה יתר (over expressed) בזן של שמרים שגורם לחלבונים מסוימים לנטות ליצור עמילואיד.

ניתן לראות בבירור שחלק מהמועמדים שלנו יוצרים עמילואיד או מינים עמידים ל-SDS בעלי משקל מולקולרי גבוה בצורה יעילה מאוד, כפי שמוצג כאן וכאן. אחרים, לעומת זאת, אינם יוצרים אגרגטים והם מונומריים לחלוטין, כגון אלה ואלה. בנוסף, ניתן לראות שגודל פולימרים העמילואיד משתנה בהתאם לחלבון, כפי שניתן לראות בשני הנתיבים הללו.

הרגע הצגנו בפניכם שיטה פשוטה לניתוח של אגרגטים בלתי מסיסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כגון עמילואידים של פריונים מועמדים. אנו מקווים שנהניתם מהצגה זו ותמצאו טכניקה זו מועילה למחקרי חלבונים אימונוגניים מסוג Amy. תודה שצפיתם בהם ובהצלחה במחקריכם.