הפרוטוקולים של זיהום Microapplicator בסיוע של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

בעוד שנגיף הבקולובירוס (baculovirus) הספציפי למפרקי רגליים משמש ככלי מחקר סטנדרטי למערכות ביטוי של חלבונים איקריוטיים, הוא מפותח גם כחומר הדברה בטוח סביבתית להשמדת חרקים, המסוגל להרוג חרקים צומחוניים כגון הפרפרים והנשפיים (lepidoptera) בטבע. זחלי Lepidoptera נדבקים בנגיפי הבקולובירוס בעת אכילת עלים נגועים. הזחלים או השדשדים בולעים את נגיף הבקולובירוס בצורה המכונה פוליהדרון (polyhedron), שהיא קומפלקס של חלקיקי נגיף הארוזים במבנה חלבוני גבישי גדול המגן על הנגיף מהתייבשות.

מרגע שהזחל נדבק, הנגיף המוטמע מפיץ את הזיהום בתוך החרק. הנגיף משתלט על מנגנוני סינתזת החומצות הגרעיניות והחלבונים של המארח כדי לייצר נגיפים ופוליהדרה (polyhedra) נוספים. בסופו של דבר, הזחלים נדבקים בנגיף באופן כה מקיף עד שהם נמסים לרסס דביק של פוליהדרה שנטף על פני השטחים של הצמח שנאכל על ידי החרק, ואז המחזור מתחיל מחדש כדי לקבוע את היעילות הקוטלת-חרקים של Baca מסוים.

ניתן לשלב טכניקות של מיקרו-מנסב (micro applicator) עבור זן Avir עם בדיקות ביולוגיות. ניתן להדביק זחלי Leid dorin על ידי הזרקה של נגיף מוטמע ישירות אל ה-HemosIL או לחלל הגוף, ולאחר מכן להעריך את שיעורי התמותה. בנוסף, ניתן להדביק זחלים באמצעות פולידרה (polyhedra) בעזרת הזרקה מסייעת של מיקרו-מנסב פומי, ובכך לבחון את תזמון ההדבקה של המעי ורקמות אחרות.

שלום, אני וונדי ספארקס מהמעבדה של בריאן בונינג במחלקה לאנטומולוגיה באוניברסיטת מדינת איווה, ואני גם מ-boning snap. היום נציג בפניכם שתי פרוצדורות להדבקת זבוב פירות מעבדה, *Drosophila*, בנגיף backlog. שתי השיטות משתמשות במאפליקטור מיקרו.

ראשית, אראה לכם כיצד להשתמש באפליקטור מיקרו כדי להחדיר וירוס לגוף אל תוך ה-heni דרך ה-prole. לאחר מכן, אראה לכם כיצד להשתמש באפליקטור מיקרו כדי להחדיר poly header אל תוך ה-mid guard דרך ה-mouse. אז בואו נתחיל.

כאשר הם מפותחים למטרות הדברה, וירוסי balo מכילים בדרך כלל את הגן של הפוליהדרון כדי להקל על הדבקה אוראלית של פשעי זחליים. עם זאת, לעיתים ישנן סיבות לבחון וירוס baccula שאינו מכיל פוליהדרון לצורך בדיקת השפעות הדברה פוטנציאליות או כדי לעקוף את מערכת העיכול של החרק. במקרה זה, ניתן לבצע הזרקה של הוירוס באמצעות מיקרו-אפליקטור כדי להדביק את הזחלים לפני תחילת הבדיקה.

יש לקבוע את הטיטר של מלאי העבודה של הנגיף המוחדר באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay) או בדיקות דילול נקודת קצה (endpoint dilution assays). עבור ניסויים פיזיולוגיים, הזרקות של 5×10⁴ PFU לכל VNS של ג'יגנתית בדרגת גוזל חמישית יהיו טיפוסיות. כדי להתחיל בבדיקה הביולוגית זו, טענו כל דילול של הנגיף המוחדר למזרק המילליטר פלסטיק עם קצה מחט חדה בכילוי 28.5 או 32.

בדרך כלל ניתן להשתמש ב-1 עד 3 µL של תמיסת נגיף מדוללת, עם titer של 10⁷ עד 10⁸ למילליטר, עבור כל זחלי. לפיכך, טעינה של 300 עד 500 µL למזרק מספיקה לרוב המטרות. לאחר מכן, הוציאו בועות אוויר מהמזרק על ידי החזקתו במצב אנכי כדי להביא את האוויר לקצה המחט, ולאחר מכן שחררו אותו.

לאחר מכן, קבעו את המזרק אל צינור התמיכה של המזרק. כעת הגדירו את הנפח ל-1.0 microliter. עבור כל טיפה, ביחידת הבקרה של המיקרו-אפליקטור המבוססת על מיקרו-מעבד, כיילו תחילה את יחידת הבקרה כדי להבטיח שמוגשת הנפח הנכון; ניתן להגדיר את המהירות שבה מוגשת הטיפה בסקאלה של אפס עד תשע.

נהוג להשתמש בטווח שבין אפס לאחד. לחצו על מתג הרגל כדי לוודא שהתמיסה מוגשת כראוי. זכרו שבמידה ומוגשת כמות גדולה מדי של תמיסה או אם היישום איטי מדי, ניתן להתאים את הגדרות הנפח והמהירות עד שיושג הנפח הנכון של התמיסה בקצב המתאים.

אני מוכן כעת להתחיל בהזרקה להדבקה ב-H VNS. בדרך כלל מזריקים לזחלים בשלב מוקדם של הגization החמישי, שכן הגודל הגדול יותר של השלבים המאוחרים מקל על תהליך ההזרקה. הכניסו את קצה המחט דרך ה-plana של אחת הרגליים הבדיריות אל תוך חלל הגוף.

שימו לב, כאשר קצה המחט נכנס לתוך הפרובה, תנוחת גוף הזחל משתנה. כדי למנוע נזק למעי ולקיר הגוף, לחצו כעת על מתג הרגל ארבע פעמים כדי להחדיר ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת הנגיף אל תוך ההמוסיל. לאחר סיום ההזרקות, החזירו את כל הזחלים למדגרה בטמפרטורה של 28 degrees Celsius. בדקו לעיתים קרובות אם ישנם זחלים מתים וודאו שזמין תזונה נאותה עבור הזחלים ששרדו.

על אף ששלבים מאוחרים של הזחלים אינם מתים מפגיעה בקוטיקולה כתוצאה מההזרקה, יש לבדוק את הזחלים 24 שעות לאחר ההזרקה למקרה של נזק למעי, שעלול להיגרם מזיהום חיידקי. תמותה מוקדמת זו יש להשמיט מניתוח הנתונים. במידה ומסמנים את הבדיקה הביולוגית בעזרת מיקרו-אפליקטור עם וירוס מושרה לצורך בדיקות של ריכוז קטלני, יש לשחזר את הבדיקה הביולוגית שלוש או ארבע פעמים במועדים נפרדים.

השתמשו ב-30 פרטים לכל מינון עבור כל טיפול בנגיף או בביקורת. השתמשו בתוכנה מתאימה לניתוח פרוביט, כגון polo או SAS, כדי לחשב ערכי lc 50, רווחי סמך של 95% ואת הסטטיסטיקות המתאימות. ניתן להשתמש בבדיקה ביולוגית זו גם כדי לקבוע ערכי זמן הישרדות ST 50 לאחר הזרקה של מינון קבוע של נגיף.

במקרה זה, תמותת הזחלים נקבעת מדי ארבע עד שמונה שעות, עם תצפיות תכופות יותר. אם שיעור התמותה גבוה, מחשבים את זמני ההישרדות החציוניים בגבולות סמך של 95% באמצעות מעריך Kaplan Meyer תוך שימוש בתוכנת s plus או SAS. כעת, לאחר שהראתה לכם Harran את הביו-בדיקה בסיוע מיקרו-אפליקטור באמצעות נגיף Butted.

אדגים לכם את הבדיקה. כאשר תזמון מדויק של ההדבקה הוא קריטי, משתמשים בהחדרה פומית של פוליהדרה ישירות למעי החרק. לדוגמה, במעקב אחר אופן התפשטות הנגיף בתוך החרק, כדי להתחיל בבדיקה זו יש לתלות פוליהדרה בתמיסה בעלת ציפה ניטרלית של גליצרין ומים ביחס של 3:2 בריכוז של 10 עד 300.

ניתן להשתמש בפוליהדרה עבור שלב הנימפה הרביעי, לדוגמה. לאחר מכן, טענו את התמיסה זו למזרק טוברקולין מפלסטיק או מזכוכית בנפח של 1 CC עם מחט קהה בכילוי 32. הניחו את המזרק על צינור התמיכה של המיקרו-אפליקטור תוך התבוננות דרך מיקרוסקופ.

החזיקו את הזחל בשלב ה-fourth או fifth instar, הכניסו את המחט דרך הפה אל האזור הקדמי של המעי האמצעי, ולאחר מכן הזריקו את הפוליהדרה (polyhedra). טכניקה זו דורשת תרגול. ראשית, עשוי להיות קשה להחזיק את הזחלים עם כפפות מבלי למעוך אותם.

שנית, נדרש תרגול כדי להעביר את המחט מעבר לאיברי הפה. אנו ממליצים לתרגל הזרקה של PBS לכ-30 זחלים. אם תנקבו בטעות את מערכת העיכול, הדבר יהיה ניכר מכיוון שהזחלים יעברו מלניזציה ויהפכו לשחורים במהירות.

שוב, מכיוון שההדבקה הפומית בעזרת מיקרו-אפליקטור מספקת את זמן ההדבקה המדויק, שיטה זו היא השימושית ביותר עבור ניסויים שבהם זמן ההדבקה חשוב כדי לקבוע כיצד הווירוס מתפשט בתוך החרק. לדוגמה, ניתן להדביק באופן פומי זחליים בווירוסים המבטאים beta galactoses dase, ולאחר מכן לבצע להם נתיחה בנקודות זמן שונות כדי לקבוע אילו רקמות נדבקו. נראה לכם שני כלים להדבקה בעזרת מיקרו-אפליקטור. חרק עם vir, כאשר הראשון היה הדבקה ישירה דרך הרגל המקדימה של וירוס מושב, ודבר זה מאפשר לעקוף את פיזיולוגיית המעי ולהעריך את הקטלניות ואת זמן הקטלניות של הווירוס שבו אתם מעוניינים.

הטכניקה השנייה הייתה הקטעה ישירה למעי האמצעי באמצעות פולידרה (polyhedra). שיטה זו מאפשרת להחדיר מינון מדויק מאוד ישירות למעי האמצעי, וכן לשלוט בתזמון מדויק של האירוע. לאחר מכן ניתן לחקור את התמותה ואת הפנוטיפים האחרים של הנגיף.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי הזחלים ההרוגים מנגיף ה-baula של ה-cadavers הם בדרך כלל שבירים ויכולים להתבקע בקלות ולשחרר את הנגיף. לכן, יש לעקר את משטחי העבודה ולהשליך כפפות מזהומות וחומרים חד-פעמיים באופן מתאים כדי למנוע זיהום. זהו כל התהליך.

תודה על הצפייתכם. בהצלחה בניסוי.